今天给同学们分享一篇生信文章“CENPF/CDK1 signaling pathway enhances the progression of adrenocortical carcinoma by regulating the G2/M-phase cell cycle”，这篇文章发表在J Transl Med期刊上，影响因子为7.4。

结果解读：

CENPF在ACC中过表达，但在肾上腺皮质腺瘤或正常肾上腺皮质组织中不表达

正常肾上腺皮质、肾上腺皮质腺瘤（良性肿瘤）和ACC（恶性肿瘤）在形态学和组织学上存在显著差异。首先，大体标本摄影显示肾上腺皮质腺瘤的结节切片呈金黄色，质地坚硬；对于ACC，包膜完整或有缺陷，一些区域呈灰红色，坏死（图第1a段）。IHC-P结果显示，与肾上腺皮质腺瘤或正常肾上腺皮质组织相比，ACC中CENPF大多上调，但肾上腺皮质腺瘤和正常组织之间没有显著差异（P < 0.001，图1b，c）。此外，这些结果在公共数据库中得到了验证，包括GEO和TCGA数据集，用于ACC患者。CENPF的mRNA表达在GSE90713中显著过表达（p < 0.01，图1d）。但有趣的是，该基因在GSE19750中的表达没有显著差异（p = 0.11，图1e）。这可能是在正常肾上腺皮质组织样本量过小的情况下（n = 4） 。同时，这场争论也吸引了作者进一步探究。此外，GEPIA数据库的相关性分析显示，与正常肿瘤相比，CENPF的mRNA表达在ACC肿瘤中明显过表达（p < 0.001，图1f），并且与ACC的肿瘤分期呈正相关（p < 0.001，图1g）。

此外，Ki67作为细胞增殖指标在ACC中进行了研究。根据Ki67阳性细胞在ACC中的比例，进一步讨论了CENPF的表达与细胞增殖之间的关系。结果，CENPF的表达，即CENPF阳性细胞的比例，与Ki67阳性细胞的比率呈正相关（p = 0.008，R = 0.85，图2a，b）。此外，基于TCGA-ACC数据集，CENPF的表达与MKI67的表达呈正相关（p = 0，R = 0.91，图2c）。提示CENPF的表达与ACC患者的细胞增殖密切相关。

CENPF在ACC患者临床病理参数中的分析

为了弄清楚ACC中CENPF表达与临床病理参数之间的相关性，将所有ACC患者分为两个亚组，根据中位数截断值，包括39个CENPFlow和40个CENPFhigh样本（图第3a段）。如表所示表1，1，CENPF的表达与年龄、性别、偏侧性和米托坦治疗无关（p > 与CENPFlow相比，CENPFhigh的ACC患者的病理分期明显晚期（尤其是III期和IV期，p < 0.001）。在肿瘤状态、新事件或残留肿瘤方面，CENPFhigh的ACC病例比CENPFlow更容易失去手术、复发或形成残留肿瘤的机会（p < 0.001）。此外，CENPFhigh组的Weiss评分更高（尤其是Weiss评分6-9，p = 0.002）。此外，血图描述了CENPF在年龄、性别、pTNM阶段和地位方面的分布（图第3b段）。此外，通过单因素和多因素回归分析，确定了CENPF与ACC患者OS的相关临床参数（包括年龄、性别、pTNM分期等）之间的相关性。结果，在单因素分析中，CENPF表达和pTNM分期与ACC患者的OS密切相关（图3c，所有p < 0.05），并且CENPF表达和pTNM分期可以在多因素分析中作为ACC患者的独立预后因素（图3d，所有p < 0.05）。最后，通过Nogram评估一名ACC患者与CENPF高表达相关的1年、2年或3年的生存率（图第3e段）。

过度表达CENPF与ACC患者的较差生存率相关

根据生存率分析，CENPF表达上调预测OS（HR = 8.66，对数秩p = 1.8e−05；图4a）和PFS（HR = 4.11，对数秩p = 6.68e−05；图4c）。ROC曲线分析表明，CENPF在OS的1年、3年和5年的AUC（图3b）和PFS（图3d）指出，CENPF的表达对ACC的预后具有良好的预测作用（所有AUC值 > 0.75）。此外，亚组分析表明，ACC患者中CENPF的过度表达是30个月、60个月和120个月OS的危险因素（所有log秩均为p ≤ 0.001，图4e–g）。

GSEA分析揭示CENPF在肿瘤发生和发展中的隐蔽分子机制

为了揭示CENPF在癌症相关信号通路中的潜在作用，进行了GSEA来解释具有CENPFlow和CENPFhigh的ACC样品的基因表达谱。根据KEGG通路的GSEA分析，CENPFhigh患者主要富集在细胞周期、DNA复制、核苷酸切除修复和p53信号通路等方面（图5a）。然后，对Biocarta通路的GSEA富集分析和Hallmark描述表明，细胞周期（NES = 2.03，p = 0；尤其是有丝分裂的G2期 = 1.96，p = 0），G2/M检查点（NES = 2.01，p = 0）和E2F目标（NES = 2.04，p = 0）在具有CENPFhigh的ACC患者中大多富集，这意味着CENPF可能通过与E2Fs蛋白相互作用来调节细胞周期（图5b）。此外，相关研究表明，E2F1在NCI-60细胞系中发挥CENPF转录因子的作用[43]，并调节G2/M期转变的细胞周期。因此，作者认为CENPF可能通过与ACC中的E2F1相互作用来调节细胞周期。Venn图表明，20个基因（CDK1、CDC25A、CDKN1A、E2F1、CCNB1、CDKN2D、ATR、TP53、ATM、CDK2、CCNE1、CDKN2A、TFDP1、CCND1、CDK6、CCNA1、CDK4、CDKN1B、CDKN2B和RB1）在至少两组中共表达（图5c）。据报道，CENPF主要调节有丝分裂中的纺锤体分离[46]。“主轴中间区域”是GESA GO术语分析中的前1个术语。通过筛选这20个基因的相关性、表达和预后，作者发现CDK1、CCNB1和E2F1在ACC样本中与正常样本相比大多过表达（图5f，所有p < 0.05），并且与CENPF的表达呈正相关（图5e，所有p < 0.01）。过表达的CDK1、CCNB1和E2F1也与ACC患者的阴性OS有关（图5g，所有p < 0.01）。此外，PPI网络显示，CENPF、CDK1和CCNB1之间存在密切的相互作用（图5小时）。因此，这表明CENPF通过与ACC中的CDK1、E2F1和CCNB1相互作用来调节细胞周期。过表达的CENPF可能在ACC进展中的G2/M期过渡介导的细胞周期的调节中发挥关键作用。

CENPF干扰对SW13细胞周期调控的影响

为了进一步探索CENPF在ACC中的作用，通过ACC细胞系人SW13细胞进行CENPF siRNA（siCENPF），作为体外实验。与siNC相比，在siCENPF中CENPF的表达被明显抑制。图6a，b）。在细胞增殖测定中，CENPF干扰明显抑制了细胞增殖（图6c）和细胞迁移（图6d），在细胞转染48小时后，在人SW13细胞中。CENPF的抑制明显降低了肿瘤细胞和基质之间的粘附（图6e）和人SW13细胞中的细胞侵袭（图6f）。此外，流式细胞术测定表明，CENPF的下调明显增强了细胞凋亡，包括细胞凋亡的早期和晚期（18.46%对36.56%，图6g）。然后，CENPF干扰诱导人SW13细胞在G2/M期转变时的细胞周期停滞（28.2%对6.4%，图6h）。如图5所示，CENPF的表达与ACC中的CDK1密切相关。因此，SiCDK1被设计用于探测CENPF和CDK1之间的相关性（附加文件9：图S1a，b）。CDK1的下调显著抑制细胞增殖（附加文件9：图S1c）和细胞迁移率（图6d）。细胞转染48小时后，CDK1的上调显著抑制肿瘤细胞和基质之间的粘附（图6e）和人SW13细胞中的细胞侵袭（图6f）。此外，流式细胞术实验显示，CDK1的下调明显增强了细胞凋亡，包括细胞凋亡的早期和晚期（18.46%对28.5%，图6g）。最后，CDK1干扰阻断了人SW13细胞G2/M期转变的细胞周期（28.2%对16.2%，图6小时）。

CENPF调节人SW13细胞CDK1表达和p53信号传导

在SW13细胞中进一步探讨了CENPF的分子机制。如图6所示，CENPF表达的抑制导致CDK1表达的降低（图6i），而CDK1的抑制对CENPF的表达没有显著影响（图6j）。提示CENPF可能调节CDK1的表达。此外，GSEA富集分析揭示了p53信号通路可能是CENPF参与人类ACC发生和发展的一种被掩盖的分子机制（图第5a段）。因此，通过Western印迹检测SW13细胞中p53（P-p53）的磷酸化、p53、p21和Bax的表达水平。由于siRNA干扰CENPF和CDK1，在SW13细胞中，与siNC相比，P-p53、p21和Bax的表达水平显著降低（图6i，j）。因此，CENPF的抑制下调了CDK1的表达，抑制了p53的磷酸化，并改变了下游蛋白水平，包括细胞凋亡和细胞周期相关蛋白。

ACC治疗的潜在治疗策略

接下来，进一步探索了可能有利于ACC治疗的可用化学药物和治疗策略，包括免疫疗法。首先，分析CENPFhigh和CENPFlow对ACC免疫细胞浸润的影响，探讨免疫疗法。TCGA数据库中的所有79个ACC组织被分为两组，其中40个CENPFhigh组织和39个CENPFlow组织的中位数。应用CIBERSORTx分析免疫细胞浸润，包括22种CENPF低表达和高表达的细胞类型。p < 0.05具有统计学意义。通过“Limma”包装标准化，然后过滤组，包括7个CENPFlow和6个CENPFhigh ACC组织，进行进一步分析。每个样本的22个免疫细胞群的表达以热图的形式呈现（图第7a段）。免疫富集评分在6个CENPFhigh和7个CENPFlow样本之间有显著差异。如图6所示，7b，与CENPFlow组相比，CENPFhigh组的ACC中主要富集卵泡辅助T细胞、M0巨噬细胞、嗜酸性粒细胞。然而，与CENPFlow组相比，CENPFhigh组的γ-ΔT细胞、单核细胞和M2巨噬细胞的免疫富集得分要低得多。主成分分析（PCA）显示，CENPFhigh和CENPFlow-ACC样本之间的免疫浸润存在明显差异（图第7c段）。这可能表明CENPF的免疫异质性在ACC患者中是显著的。另外，LAG3、CTLA4、PD-1、PD-L1和HAVCR2的mRNA表达与肿瘤免疫抑制或耐受性密切相关，与CENPFlow相比，CENPFhigh的ACC中LAG3、CTRA4、PD-1和HAVCR2的mRNA表达没有显著差异（图7d，所有p > 0.05）。此外，分析了CENPF的表达与MSI或TMB之间的相关性，发现CENPF表达与MSI评分显著相关（图7e，p = 0.034）和TMB评分（图7f，p < 0.01）。这表明CENPF的过表达可能会增加ACC中DNA复制过程中异常基因突变即TMB的积累。然后，基因-药物相互作用网络表明，多种药物可能会影响CENPF在mRNA或蛋白质水平上的表达水平（图第7g段）。例如，顺铂、舒尼替尼和依托泊苷可以抑制CENPF的表达水平，而紫杉醇和金雀异黄素可以诱导CENPF表达水平。一般来说，所有这些CENPF抑制剂都被认为是治疗ACC的潜在靶点。

总结

总之，本研究指出CENPF在ACC患者中显著过表达。过度表达的CENPF预测ACC的预后不良，并可能增加ACC的进展。结果表明，CENPF可能被视为ACC患者的预后生物标志物或治疗靶点。根据体外实验，CENPF的过表达上调了CDK1，介导了G2/M期转变、细胞增殖、细胞迁移、细胞侵袭以及TMB和MSI的积累。此外，CENPF的过表达可能激活p53信号通路，从而发挥潜在的抗肿瘤作用。总之，该研究强调了关于CENPF和相关信号通路的积累证据，这可能为开发CENPF介导的治疗药物或制定ACC患者个体化治疗策略提供有益的启示。