荧光EEM平滑教程（去除散射）

说明：本文为drEEM工具箱官网教程《Smoothing EEMs》的笔记。

瑞利散射是一种弹性散射。来自激发源的光子遇到溶液中的分子之后，反弹到各个方向。最重要的是，瑞利散射（的发射波长）总是与激发波长完全相等。因此，EEM中的瑞利散射表达式为Ex=Em。

拉曼散射是一种非弹性散射。与瑞利散射相比，来自激发源的光子比例要小得多，它们冲击分子并造成非弹性散射。

对角线散射信号不能用于PARAFAC建模，因为它们的行为不是三线性的，需要进行处理。

一、确定散射切除参数

EEM中包含的散射有一阶瑞利、一阶拉曼、二阶瑞利、二阶拉曼，如下图所示。
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下载本文顶部的资源Xstart.mat，将其导入工作区。该文件含有一个变量Xstart，类型为drEEM-dataset。

执行命令eemreview(Xstart,'samples',10)，弹出窗口。点击Spectra按钮，鼠标变为定位十字。在对角线上选择一个峰，使得ex线在此处穿过两个峰。左键单击，可在em图中看到2个尖峰，黑线穿过的是预测的拉曼峰，红线穿过的是预测的瑞利峰。根据尖峰两侧的曲线走势，可以修复出尖峰处的原始数据。
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（1）一阶拉曼、二阶瑞利
①将光标移到em图上，读取2个尖峰顶的Y值。
②接下来确定散射峰的边界。读取尖峰两端的X值。
③以尖峰顶为界，可以将散射峰分为左右两个部分，即小于部分和大于部分。
④确定Ram1,Ray2参数：参数取值为二元组[大于部分区间长度小于部分区间长度]。使用smootheem函数移除散射。示例命令：eemreview(smootheem(Xstart,[ ],[9 11],[16 14],[ ],[0 0 0 0],[],3382,0))

（2）一阶瑞利
观察ex图，可以看到曲线的末尾部分与横轴重合。这些零值可能是散射归零造成的。然而，这样的数据是有问题的，因为散射可能掩盖了有机物荧光。因此，应该移除这些零值。
①从ex图确定曲线与横轴交点到散射竖线的距离，作为右半长度。
②从em图确定曲线与横轴交点到散射竖线的距离，作为左半长度。
③确定Ray1参数：[左半长度右半长度]。使用smootheem函数移除散射。示例命令：eemreview(smootheem(Xstart,[7 6],[9 11],[16 14],[ ],[0 0 0 0],[],3382,0))

（3）二阶拉曼
在二阶拉曼区域，等高线不平滑，但很难辨认出散射对角线。
①通过遍历，找出散射明显的样本，如下图所示。
②点击Spectra按钮，然后单击散射峰。在em图中找到黑色竖线，以其为界将散射峰分为左右两个部分，即小于部分和大于部分。
③确定Ram2参数：[大于部分长度小于部分长度]。使用smootheem函数移除散射。示例命令：ds = smootheem(Xstart,[7 6],[9 11],[16 14],[20 4],[0 0 0 0],[],3382,0)
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二、微调散射切除参数

可以使用scanview函数查看每一张光谱中的散射切除情况。DOM荧光是平滑而宽泛的（broad），而残留的散射残留则会表现为荧光骤增。然而，如果样本数较多，逐个检查将是枯燥乏味的。此时，可以使用spectralvariance函数。该函数可视化所有样本的差异，并将差异汇总到一个图（称为标准差EEM）中。

执行命令spectralvariance(ds)，命令行输出的警告信息如下：

Some samples have very little signal (e.g. blanks) and thus likely negatively impact the
results 
Consider removing the sample(s):  7   8   9  10  86  87  88  89
If no blanks (or similar) samples are present, the issue may be samples with high fluorescence values instead.

（1）使用subdataset函数，OutSample取值[7:10 86:89]：Xtemp=subdataset(ds,[7:10 86:89],[],[])。执行命令spectralvariance(Xtemp)，这次没有警告信息。放大标准差EEM仔细观察，发现一阶瑞利散射两侧等高线密集（看起来像阴影，称为残余），如下图所示。
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（2）尝试扩展散射，即将Ray1参数两头各加5，即[7+5 6+5]，重新处理得到新数据集。对其使用spectralvariance函数，这次一阶瑞利散射没有残余，但是一阶拉曼散射有残余，如下图所示。

（3）调整Ray1=[9 11+5]，重新处理得到新数据集。对其使用spectralvariance函数，这次一阶拉曼散射没有残余，但是二阶拉曼散射有残余，如下图所示。
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（4）调整Ray2=[20 4+10]，重新处理得到新数据集。对其使用spectralvariance函数，这次所有散射都没有残余。然而，应该注意到，光谱底部是空白的，其上界约为em=300nm。应该将这部分空白裁剪掉。示例代码：ds=subdataset(smootheem(Xstart,[12 11],[9 16],[16 14],[20 14],[0 0 0 0],[],3382,0),[7:10 86:89],[Xstart.Em<300],[])。剩余的问题：左上角有一块空值三角形（由移除二阶拉曼散射造成）。注意这一波段的建模结果。如果组分在这一波段看起来奇怪，则需要使用subdataset函数切除包含空值三角形的em段。