一种多信号线粒体靶向荧光探针，用于同时区分生物硫醇并实时可视化其在癌细胞和肿瘤模型中的代谢

文献来源:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S003991402300855X?

该探针应用：

·用于区分生物硫醇，并依次检验代谢物 $SO_{2}$ 。

·实时监测细胞、斑马鱼和肿瘤中的生物硫醇代谢。

一、背景介绍

生物硫醇

（1）种类

生物硫醇是含有巯基的小有机分子，广泛存在于生物体中，包括同型半胱氨酸（Hcy），半胱氨酸（Cys）和谷胱甘肽（GSH）。

（2）主要分子的作用

GSH是细胞中含量最丰富的生物硫醇分子，调节细胞生长和正常细胞功能中的氧化还原平衡。

Hcy是蛋氨酸代谢的中间产物，可产生Cys。

Cys参与多种蛋白质的合成，主要包括GSH，也是细胞内硫代谢的核心物质。

二、新型探针

1.新型探针合成

在哌嗪的催化下，2,5-羟基-1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚-1-碘化物（1）和香豆素衍生物（2）生成关键的中间探针1，然后用探针1处理NBD-Cl，一步反应合成探针2

2.探针2的荧光特性

选择性响应、时间响应和pH依赖性

3.新型探针的作用原理

通过三个明确定义的发射带（红-绿-蓝）的变化来依次监测Cys、Hcy和GSH的新陈代谢

方案 1.（A）探针2通过红绿荧光比变化区分初级生物硫醇，通过红蓝荧光比变化实时监测代谢的新策略。（B）探针2对Cys/Hcy、GSH和 $SO_{2}$ 的响应机制具有三个明确定义的发射带。

三、数据解读

1.紫外图像的数据解读

1.1 探针对生物硫醇和 $SO_{3}^{2-}$ 的光谱响应

随着Cys或Hcy的增加，分别在550 nm（绿色通道）和650 nm（红色通道）处观察到两个最大发射（图1A和C），这归因于产物探针1和NBD-Cys/NBD-Hcy。而加入GSH后，仅观察到650 nm处的逐渐增强（图1B），表明生成了红色荧光产物（探针1）和深色单取代巯基NBD（NBD-GSH）。当 $SO_{3}^{2-}$ 添加后，观察到 480 nm 处的荧光（蓝色通道）（图1D），表明 $SO_{3}^{2-}$ 可以通过独特的亲核加成与探针 2 的碳碳双键反应。

总体而言，探针 2 可以同时区分 Cys/Hcy、GSH 和 $SO_{3}^{2-}$ 通过三个明确定义的发射带（红-绿-蓝）的荧光变化，两个相邻波段之间的分离距离相对较大。

1.2 探针 2 对 $SO_{3}^{2-}$ 在生物硫醇存在下的光谱响应

如图2所示，在与Cys/Hcy共存的情况下，480 nm处的荧光显著增强，650 nm处的荧光逐渐降低，而550nm处的荧光几乎没有变化。在存在 GSH 的情况下，添加 $SO_{3}^{2-}$ ，650 nm 和 480 nm 处的荧光也发生了变化。此外，发射强度比（I650/I480）和 $SO_{3}^{2-}$ 在Cys、Hcy和GSH存在下发现浓度。因此，结果表明探针2可用于监测生物硫醇在体外和体内的代谢过程（表S1）。

1.3生物硫醇和 $SO_{2}$ 的鉴别检测和在活细胞中的可视化

在没有NEM（N-乙基马来酰亚胺）的情况下，成像结果（图3A）显示微弱的绿色和蓝色荧光，但由于肿瘤细胞中的高GSH而显示出相对明亮的红色荧光。

作者在对 MCF-7 细胞(乳腺癌细胞)中的内源性生物硫醇进行预处理以去除 n-乙基马来酰亚胺（NEM）后，探针 2 在三个通道中显示出非常微弱的荧光（图3B)

探针和探针与 $Na_{2}S_{2}O_{3}$ 孵育后，红色荧光显著降低，而蓝色荧光显著增强（图3G-I）

1.4活细胞中生物硫醇代谢的荧光成像

如图4A–F所示，红色通道中的荧光迅速增加，并在30 min处达到峰值，绿色通道中的荧光也产生相似变化。30 min后，蓝色通道中的荧光开始逐渐增加，并在80-90 min时达到最亮，而红色荧光减少，这意味着内源性 $SO_{3}^{2-}$ 在细胞内生产。该实验证明，GSH代谢可以产生 $SO_{3}^{2-}$ 在 MCF-7 细胞中。

作者通过探针 2 研究了GA（藤黄果酸gambogic acid）对 MCF-7 细胞中 GSH 代谢的影响。

如图4H-L所示，随着GA的增加，红色荧光明显低于对照组，但蓝色通道的荧光强度逐渐增加。GA细胞中红色通道与蓝色通道的比例也降低，表明MCF-7细胞的GSH代谢在药物干预下增强。基于流式细胞术对MCF-7细胞的凋亡结果，GA可能促进GSH代谢，加速抗肿瘤的氧化还原过程。

流式细胞术：对悬液中的单细胞或其他生物粒子，通过检测标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量分析和分选的技术。

1.5 斑马鱼生物硫醇代谢的荧光成像

红色荧光在0-30 min内逐渐增加，在60-90 min内减少，而蓝色荧光在0-90 min内缓慢增加。结果表明，SO2在斑马鱼的生物硫醇代谢过程中产生。

1.6MCF-7肿瘤模型中生物硫醇代谢的荧光成像

作者探究生物硫醇代谢与癌症的关系，建立了MCF-7皮下肿瘤模型，并使用探针2监测肿瘤中生物硫醇的代谢变化（图5A-C）。以皮下注射为对照组，肿瘤中的红色荧光在60 min时达到最大值，然后逐渐降低，可能是因为肿瘤模型中大量的GSH导致SO浓度升高2通过肿瘤区域的酶促反应。

在不同时间使用探针 2 观察正常肿瘤和 GA 治疗肿瘤中冷冻切片的荧光变化。如图5D和E所示，在50 min时，两组在生物硫醇成像的红色通道中均有显著荧光，与对照组相比，GA组的红色荧光较低。在90 min时，由于 $SO_{2}$ 的产生，两组的红色荧光均降低.在 $SO_{2}$ 的蓝色通道中成像结果显示，两组的蓝色荧光随时间推移缓慢增强，但GA组的蓝色荧光略高于对照组。GA组红通道与蓝通道的比例在不同时间均小于对照组，表明GA干预下肿瘤中的生物硫醇代谢增强。