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分析体细胞突变时，通常采用tumor_vs_nomal 的实验设计。在检测时，由于同时会检测出生殖细胞突变和体细胞突变，需要做的就是去除生殖细胞突变位点，那么剩下的就是体细胞突变位点了，GATK4 采用Mutect2 检测体细胞突变，分析流程如下：

1. 根据normal 样本得到 panel of normal

首先对每个normal 样本，运行Mutect2

gatk Mutect2 \-R reference.fa \-I normal1.bam \-tumor normal1_sample_name \--germline-resource af-only-gnomad.vcf.gz \-O normal1_for_pon.vcf.gz

然后使用CreateSomaticPanelOfNormals命令创建panel of normal

gatk CreateSomaticPanelOfNormals \-vcfs normal1_for_pon_vcf.gz \-vcfs normal2_for_pon_vcf.gz \-vcfs normal3_for_pon_vcf.gz \-O pon.vcf.gz

2. normal_vs_turmor 得到体细胞突变

命令如下：

gatk Mutect2 \-R reference.fa \-I tumor.bam \-tumor tumor_sample_name \-I normal.bam \-normal normal_sample_name \--germline-resource af-only-gnomad.vcf.gz \--af-of-alleles-not-in-resource 0.00003125 \--panel-of-normals pon.vcf.gz \-O somatic.vcf.gz

mutect2检测时，是成对检测的，需要一个normal bam 和 turmor bam， germline-resource指定一个生殖细胞突变的vcf文件，这里选择的是gnomAD数据库 ，链接如下

http://gnomad.broadinstitute.org

这个数据库收集了大量外显子和全基因组测序的SNP calling结果。af-of-alleles-not-in-resource指定germline-resource 变异位点的频率，低于该频率的位点认为是一个不可靠的生殖细胞突变位点。panel-of-normals指定第一步生成的pon.vcf.gz文件。

3. 过滤VCF文件

第一步，运行GetPileupSummaries

gatk-launch GetPileupSummaries \-I tumor.bam \-V small_exac_common_3.vcf \-O pileups.table

第二步，运行CalculateContamination

gatk-launch  CalculateContamination \-I pileups.table \-O contamination.table

第三步，运行FilterMutectCalls

gatk FilterMutectCalls \-V somatic.vcf.gz \-contamination-table contamination.table \-O filtere

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