原创：yongzhe

提到cfDNA应用于肿瘤早期筛查，是一个充满希望和挑战的问题。目前的热门方向是甲基化，相当多一部分公司以此为研发方向，还包括ctDNA突变检测，cnv检测，CTC，外泌体检测等都在探索研究中。今天介绍的是ctDNA的突变检测作为肿瘤早期筛查的方法，国内外也有公司研究并作出不错的成果，主要结合两篇文献进行分享。
首先要明确的是早筛早诊的临床意义。针对的对象是肿瘤发病高危人群和表现出一定症状需要确诊的病人，以及判断早期肿瘤是否会发生转移的问题。有研究认为，1/3的肿瘤是可以治愈的，这其中早筛早诊将会起到重要作用。

第一篇文献首先介绍了一种超灵敏度的检测ctDNA突变的方法（TEC-Seq）。
该流程 检测55个与肺癌，结直肠癌，乳腺癌，卵巢癌相关的高频突变基因作为阳性信号，以及3个与克隆性造血突变的相关基因（认为是假阳性信号，需要排除）。55个基因确定是通过分析COSMIC数据库，发现至少3/4的样本在55个基因上至少包含1个突变位点。平均测序深度约30000X，通过内源性（mapping的起始终止位置）和外源性双端barcode方法，检测低至0.1% 的突变。在0.1%的频率阈值下，该方法检测突变的灵敏度为89%，特异性为100%。
作者首先使用该方法检测了正常人的血浆样本，没有发现肿瘤相关突变。但是检测到了克隆性造血突变，都在DNMT3A基因上。
随后作者使用该方法检测了 4种肿瘤（乳腺癌，结肠癌，肺癌，卵巢癌）的194个病人的血浆样本。ctDNA的含量在在晚期肿瘤中的浓度更高。晚期肿瘤（stage III and IV）检出率为 > 75%, 早期肿瘤检出率为62%。80/128 个病人中至少检出一个热点突变。每个病人平均检出2.1个突变。

第二篇文献介绍了另一种血液检测方法CancerSEEK，结合基因检测和蛋白marker检测用来确定实体肿瘤远端转移的早期预测。
作者首先通过公共数据库，确定了只需要16个基因的61个扩增子，即能够在8种肿瘤类型中检测到至少一个突变位点。每个扩增子的长度为33bp。该panel 能够检测COSMIC数据库中41%（肝癌）~95%（胰腺癌）的突变集合。
CancerSEEK 检测ctDNA的部分结合barcode方法来降低错误率，同时通过多等分样本，同时进行独立分析，以增加信噪比，检测低频突变。CancerSEEK 另一部分是检测蛋白marker。作者通过文献查找到41种符合灵敏度和特异性要求的蛋白marker，然后通过实验证实最终选取8种作为检测marker（包括CA-125，CEA，CA19-9，PRL，HGF，OPN，MPO，TIMP-1）。
作者研究了1005个 I期-III期的肿瘤病人，肿瘤类型包括卵巢癌，肝癌，胃癌，胰腺癌，食管癌，结肠癌，肺癌，乳腺癌。利用检测到的突变信号和蛋白水平变化，构建逻辑回归模型，给每个检测样本打分。
CancerSEEK在8种肿瘤类型中敏感性平均是70%，在不同肿瘤类型中有差别。乳腺癌中最低（33%），卵巢癌中最高（98%）。特异性>99%。 在不同肿瘤阶段的敏感性 73%（stage II ），78%（stage III），43%（stage I）。同时该方法还能辅助判断肿瘤的来源，实现单靠ctDNA突变检测无法溯源的缺陷。通过该方法检测到的ctDNA突变和组织一致性在90%。能够准确反映肿瘤形成过程中产生的突变。
同时作者结合ctDNA突变信息，蛋白表达水平和一些患者信息，使用有监督的机器学习方法构建模型来预测肿瘤类型，以便能够对CancerSEEK阳性结果的患者选择合适的随访诊断方法。使用该模型对626个CancerSEEK阳性的患者进行分析，平均能够将83%的患者病灶定位到两个器官，平均63%的患者精确到一个器官。预测的准确性在不同肿瘤类型中差异较大。由于驱动突变并没有组织特异性，因此这种定位信息主要来源于蛋白marker。

总结：
目前ctDNA突变检测应用于肿瘤早期筛查，主要依赖 高灵敏度的检测方法，以及能覆盖大部分肿瘤驱动突变的panel 基因集合。但仅仅依靠突变还无法追踪到肿瘤来源。像文章中提到的，未来期望多组学结合的方法能提高检测灵敏度，实现早期筛查和追踪溯源。

参考文献：
Phallen J, Sausen M, Adleff V, et al. Direct detection of early-stage cancers using circulating tumor DNA[J]. Science translational medicine, 2017, 9(403): eaan2415.
Cohen J D, Li L, Wang Y, et al. Detection and localization of surgically resectable cancers with a multi-analyte blood test[J]. Science, 2018: eaar3247.

（公众号：生信了）