【2020-05】二代测序在肿瘤突变高灵敏度检测中的应用：挑战、进展和应用 （综述） 5.341 (3区Q1)

文献摘要

文献介绍了NGS检测工作流程中的错误来源，以及非NGS检测方法介绍及其优缺点。具体包括：

1）序列伪影（artifacts，假象/错误的/人为加工过的）产生的来源

• 组织和DNA处理：FFPE/福尔马林固定、DNA超声波打断
• NGS处理过程：PCR扩增、测序错误
• 随机低水平的假基因突变（NGS常规流程无法识别）
• 妥协的NGS下限（LOD）（NGS的下限LOD受到限制）

2）首选的替代技术（非NGS）：

• 实时多特异PCR；
• ddPCR：微滴数字PCR；
• BEAMing：数字PCR流式技术（ddPCR的简易版）；
  BEAMing is an improvised version of ddPCR

3）非NGS的优缺点

• 优点：
  • 高灵敏度；
  • 定量突变检测；
  • 绝对定量的可行性；
  • 易于纳入实验室工作流；
• 缺点：
  • 仅适用已知突变；
  • 为每个突变等位特异性设计；
  • Low multiplexing capability and throughput（容纳的样本和数据量少？）；
  • 更多的DNA起始量，跟marker数相关；
  • 不适用突变筛查和识别新突变；

LOD（LIMIT OF DETECTION）就是检测限，在变异检测突变频率中的LOD，一般是，在指定的LOD频率下，95%的测试样品将被可靠地检测到。对于，有限个基因组合、全外显子组测序和全基因组测序，报告的LOD范围为2%至15%变异等位基因频率，也就不足为奇了。

NGS工作流程中的错误来源

1）FFPE样本：

福尔马林固定对核酸的完整性、提取效率和扩增性有不利影响：广泛的DNA片段化，DNA产量降低，化学修饰，C:G>T:A single-nucleotide artifacts，generation of abasic sites by depurination（通过脱嘌呤产生非碱性位点）。它们导致DNA扩增能力降低并诱导伪影，包括单核苷酸变异、短缺失以及嵌合和链分裂读伪影。这些伪影是散发的和非特异性的，通常表现为低水平序列变异。

这些通过改进实验条件降低错误。

2）DNA打断：

产生低水平的8-氧鸟嘌呤病变（ low-level 8-oxoguanine lesions ）导致G:C>T:A 伪影。

3）PCR扩增和聚合酶保真度：

扩增子法和靶向富集（探针捕获）都在获得目标序列后进行PCR扩增。测序的准确性取决于DNA的质量/含量、PCR循环次数以及聚合酶的保真度及其处理核酸伪影的能力。

Because both of these methods rely on PCR, the final sequencing accuracy is dependent on the quality and quantity of DNA, the number of PCR cycles, and the fidelity of polymerases and their ability to deal with the nucleic acid artifacts.

虽然高保真聚合酶的错误率为百万分之一碱基对（错误率为$10^{-6}$）通常用于NGS工作流程，使用过多的PCR循环和低质量的DNA以及加工诱导的化学修饰使问题更加复杂，导致测序伪影。此外，在DNA链的克隆扩增过程中聚合酶诱导的PCR错误（以分离和扩增每个DNA文库链以进行测序）以及通过合成进行的实际测序也会导致额外的错误。高GC- and AT区域扩增不足。

4）测序平台：

Illumina平台的总体测序错误率在0.25%至0.8%之间。Ion Torrnt的插入缺失测序错误率为1.1%至2%，而替换误差不显著（0.04%至0.1%）

5）数据分析：

序列比对，其中重复序列的存在以及复杂插入和删除的发生可能导致错位，从而对变体调用产生不利影响。

NGS工作流错误解决策略

使用UID

Template tagging模板标记（UID）：Inability to identify artifacts that are pre-analytic or during the first PCR cycle of UID inclusion (jackpot mutations)

Duplex sequencing双链UID；

Single-molecule sequencing；

不使用UID

尽管一些不用UMI的方法代表了非UID重大改进，但在常规临床实验室的适用性和对临床试验预期标准的性能尚未得到证明。

（1）方式1：双链邻近测序（Pro-Seq）：一种无需分子条形码冗余成本即可提高DNA测序准确性的方法 3.752 (3区Q2) 2018-10

双链邻近测序在物理上链接每个模板DNA链的拷贝，以便在测序过程中将两条双链测序为单个簇，并且簇中检测到的突变体可以追溯到两条DNA链（+和−），而无需使用UID进行双链测序

duplex proximity sequencing physically links copies of every template DNA strand so that both the duplex strands are sequenced as a single cluster during sequencing, and the mutant detected in the cluster can be* traced back to both DNA strands (+ and −)* without the need for duplex sequencing with UIDs

Pro-Seq是一种新颖的NGS文库构建和分析方法，该方法可实现与最佳条形码方法相当的性能，但不会增加测序和后续测序成本。通过物理链接分子拷贝，将每个模板的多个拷贝合并为单个测序，从而播种单个测序簇。

Using both cfDNA and cell line DNA, we report the average per-mutation detection threshold and per-base analytical specificity to be 0.003% and >99.9997% respectively.

(2) 方式2：用于超罕见变异检测的无条形码二代测序错误验证 17.694 (1区Q1) 2019-02

提出了一种具有成本效益的NGS错误验证方法。通过物理提取和单独扩增错误读取的DNA克隆，我们将频率>0.003%的真实变体与系统NGS错误区分开来，并在NGS后选择性地验证NGS错误。我们实现了 PCR 诱导的错误率为 2.5×10^-6每个碱基每次加倍事件，与以前的研究相比，使用的测序读数减少了10倍。

非NGS平台的高灵敏度检测

1） 实时荧光定量PCR：

测定在 1 到 2 个目标分子上的总体 LOD，并且在更高的数量级（16 到 20 个分子）上确定了定量限。对于变异检测，LOD和定量限分别高达0.0002%和0.0008%（在一百万条野生型链的背景中建立2至8条变异链）

2）微滴数字PCR（ddPCR）：

已经为ddPCR建立了0.1%的LOD（1个野生型拷贝背景中的1000个变异拷贝），如果使用更高的DNA输入量，可以提高一个或两个数量级（0.01%和0.001%）。

3）BEAMing is an improvised version of ddPCR，VAF 的常规 LOD 在 0.01% 至 0.02% 之间，可通过一些手段提高到<0.01%。

然而，这些平台适用于检测已知的突变，主要是一次检测一个突变。

NGS应用

MRD:

• MRD水平LOD定义，其通常为0.01%（万分之一）。

  （1）最近的一项研究使用24基因NGS组合检查了急性髓性白血病MRD的估计，该组合调整了错误抑制（通过校对聚合酶和低PCR循环数来限制PCR错误）和纠错（分子条形码或UID）。LOD高达0.016%VAF。
  Measurable residual disease monitoring by NGS before allogeneic hematopoietic cell transplantation in AML

  （2）另一项NGS研究使用了一组四个基因（IDH1，IDH2，NPM1和FLT3），其纠错方法仅跟踪热点突变并统计过滤位置特异性测序伪影。通过流式细胞术和定量ASPCR建立了0.01%（SNV）和0.001%（插入缺失）的LOD。
  A novel deep targeted sequencing method for minimal residual disease monitoring in acute myeloid leukemia - PubMed

ctDNA早筛：

（1）之前研究无UID：

• 扩增子：六个基因中的靶区进行两步扩增，2%VAF的LOD和97%的特异性（改进前）。改进：增强的文库制备效率以及统计分析算法，36 个肺癌相关基因LOD 低至 0.25% VAF。
• 杂交捕获：个性化分析，其显示中位LOD为0.1%VAF，特异性为99%。
• 然而，在没有任何纠错方法的情况下，这些方法的置信度可能被认为不足以常规筛查<0.1%VAF的突变。

（2）使用UID：

筛选54个癌症相关基因的SNV，插入缺失和基因拷贝数变异和融合，显示出0.1%VAF的一致LOD以及显着的分析特异性（99.999%）。更大的73基因癌症相关基因面板被验证为ctDNA的临床试验。该测试表明检测灵敏度为0.02%至0.04%LOD。