原文链接:模式植物构建orgDb数据库 | 以org.Slycompersicum.eg.db为例

本期教程

一步构建模式植物OrgDb数据库

source("../Set_OrgDb_Database.R")# 使用函数
Set_OrgDb_Database(emapper_file = "out.emapper_tomato.csv",  ## 输入的eggnog结果文件json_file = "ko00001.json",               ## 下载ko00001.json，下载网址：https://www.genome.jp/kegg-bin/get_htext?ko00001tax_id = "4081",                          ## 物种信息genus = "Solanum",species = "lycopersicum",versions = "4.0",                         ## 版本号maintainer = "du<1678871583@qq.com>",     ## 修改为你的名字和邮箱author = "du<1678871583@qq.com>",         ## 修改为你的名字和邮箱outputDir = "."                           ## 保存路径
)

获得本期教程文本文档，在后台回复：20240802。注意：一步构建模式植物OrgDb数据库Set_OrgDb_Database()函数教程可在社群中获得。请大家看清楚回复关键词，每天都有很多人回复错误关键词，我这边没时间和精力一一回复。

写在前面

前期，我们发表过模式植物GO背景基因集制作，这些教程也算是比较“经济实惠”、且常用的。在我们制作分析是会遇到的问题，随着前面教程推出，也有同学咨询如何制作KEGG背景文件。今天，自己也查了相关的教程，进行整理一下。最开始的目标是，将我们注释文件进行本地打包建库，使用时就会更加的方便。但是，在此过程中，出现一些问题，目前还未解决。那就安排到下一期的内容吧。

一、使用ggNOG-mapper仅需注释

1 模式植物KEGG注释

本次使用Egg-mapper进行注释，网页版可以支持proteins/CDS/genomic/Metagenomic和seeds文件格式。

1.1 下载模式植物序列

本次事例中，我们使用Proteins文件进行注释。使用番茄（tomato）蛋白序列，你可以使用其它序列。

wget https://solgenomics.net/ftp/genomes/Solanum_lycopersicum/annotation/ITAG4.0_release/ITAG4.0_proteins.fasta

1.2 上传到ggNOG-mapper

1. egg-mapper网址

http://eggnog-mapper.embl.de/

2. 上传蛋白序列
   

3. 输入邮箱
   

4. 提交
   

5. 邮箱中收到eggNOG-mapper发送的邮件
   

6. 开始运行【重点】
   在我们收到邮件时，很多同学可能会认为此任务已经开始（PS：自己也是这么认为的）。但是，我们需要点击Click to manage your job进去工作台，点击start job
   
   进入工作台
   
   开始运行工作文件后台界面
   

1.3 下载注释文件

若你提交的任务结束，可以到工作任务后台下载数据。

下载数据

2 本地运行

2.1安装egg-mapper软件

1. conda或mamba安装

mamba install -c bioconda -c conda-forge eggnog-mapper
or 
conda install -c bioconda -c conda-forge eggnog-mapper

2. 源码安装

下载网址：
https://github.com/eggnogdb/eggnog-mapper/releases/tag/2.1.12

3. 帮助文档网址

https://github.com/eggnogdb/eggnog-mapper/wiki/
## v2.1.5版本帮助文档
https://github.com/eggnogdb/eggnog-mapper/wiki/eggNOG-mapper-v2.1.5-to-v2.1.12#user-content-Software_Requirements

2.2 安装软件需求

- Python 3.7 (or greater)
- BioPython 1.76 (python package) (BioPython 1.78 should work since emapper version 2.1.7)
- psutil 5.7.0 (python package)
- xlsxwriter 1.4.3 (python package), only if using the --excel option
- wget (linux command, required for downloading the eggNOG-mapper databases with download_eggnog_data.py, and to create new Diamond/MMseqs2 databases with create_dbs.py)
- sqlite (>=3.8.2)

2.3 硬盘储存需求

1. eggNOG annotation databases：~40 GB
2. eggNOG sequences:~9 GB
3. MMseqs2 database of eggNOG sequences:~11 GB(~86 GB if MMseqs2 index is created)
4. PFAM database：~3 GB

2.4 内存需求

- Using --dbmem loads the whole eggnog.db sqlite3 annotation database during the annotation step, and therefore requires ~44 GB of memory.
- Using the --num_servers option when running HMMER in server mode (a.k.a. hmmgpmd, which is used for -m hmmer --usemem, --pfam_realign denovo or hmm_server.py) loads the HMM database as many times as specified in the argument (e.g. --pfam_realign denovo --num_servers 2 loads the PFAM database into memory twice, with up to roughly 2 GB per instance).

2.5 数据库下载

下载网址：http://eggnog6.embl.de/#/app/downloads

在eggnog_6.0版本中提供此下载数据信息

使用软件自带的脚本下载数据库：

download_eggnog_data.py -h

注意，我们这里使用conda或mamba，以及添加到$PATH路径中，可以直接运行。若你使用源码安装，及未添加路径，需求添加python /PATH/download_eggnog_data.py -h运行。

下载数据库整体命令：

download_eggnog_data.py --data_dir /home/Data/DataBase/Eggno_Database/ -y -F -D -H

参数选择：

options:-h, --help       show this help message and exit-D               Do not install the diamond database (default: False)-F               Install the novel families diamond and annotation databases, required for "emapper.py -m novel_fams" (default: False)-P               Install the Pfam database, required for de novo annotation or realignment (default: False)-M               Install the MMseqs2 database, required for "emapper.py -m mmseqs" (default: False)-H               Install the HMMER database specified with "-d TAXID". Required for "emapper.py -m hmmer -d TAXID" (default: False)-d HMMER_DBS     Tax ID of eggNOG HMM database to download. e.g. "-H -d 2" for Bacteria. Required if "-H". Available tax IDs can befound at http://eggnog5.embl.de/#/app/downloads. (default: None)--dbname DBNAME  Tax ID of eggNOG HMM database to download. e.g. "-H -d 2 --dbname 'Bacteria'" to download Bacteria (taxid 2) to adirectory named Bacteria (default: None)-y               assume "yes" to all questions (default: False)-f               forces download even if the files exist (default: False)-s               simulate and print commands. Nothing is downloaded (default: False)-q               quiet_mode (default: False)--data_dir       Directory to use for DATA_PATH. (default: None)

2.6 运行

HMMER方法
本地检索细菌数据库
-i输入、—output输出文件前缀、-d指定数据库数据、—data_dir指定数据库位置

python emapper.py -i test/polb.fa --output polb_bact -d bact --data_dir ~/data/db/eggnog

diamond方法
-m指定diamond方法，默认为hmmer方法。diamond在多于千条序列时才会体现速度优势，少量序列会感觉非常慢，而且结果也没有hmmer的更准确，尤其是对远源注释方面。

python emapper.py -i test/polb.fa --output diamond_bact_ -d bact --data_dir ~/data/db/eggnog -m diamond

此外，作者也在推文或帮助文档中说明，可以增加内存和线程数量，使用--usemem增加内存,使用--cup增加线程数，--override是强制覆盖结果。

python emapper.py -i test/polb.fa --output diamond_bact_ -d bact --data_dir ~/data/db/eggnog --usemem --cpu 10 --override -m diamond

跟多细节请查看官网即可：

https://github.com/eggnogdb/eggnog-mapper/wiki/eggNOG-mapper-v2.1.5-to-v2.1.12#user-content-Software_Requirements

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对于使用在线eggNOG-mapper还是自己在服务器中进行搭建呢？

对于这个问题，每个人分析的环境不同以及资源不同，我们根据自己的环境和资源进行合理调整即可。

1. 若手中的有充足资源服务器，可以自己搭建，有利于后续流程的搭建和分析。
2. 若自己手中并未有那么充足资源，其实使用在线的分析也可以，足够使用。

3 结果分析

运行成功后，我们获得一下注释文件信息。如何操作，就成为后续分析重点。类似思路，可以依据模式植物GO背景基因集制作。

标注的信息就是我们制作KEGG背景文件重要的信息。

我们在这里可以发现，在egg-mapper中注视到GO ID，那么是不是GO背景文件也可以使用这个文件进行制作呢？？与前期的教程有何差异呢？？

结果解读：

第一列：查询序列名称
第二列：eggNOG种子序列
第三列：eggNOG种子序列 evalue
第四列：eggNOG种子序列 bit score
第五列：匹配的OGs
第六列：最大的OG分类等级
第七列：COG功能分类
第八列：OGs最低分类等级物种描述
第九列：首选名称
第十列：GOs, 预测的GO，逗号分隔
第十一列：EC，预测额EC
第十二列：KEGG_KO: 预测的KO
第十三列：KEGG_Pathway：预测的ko通路
第十四列：KEGG_Module：预测的ko功能单元
第十五列：KEGG_Reaction：预测的酶促反应
第十六列：KEGG_rclass：预测的ko相关类
第十七列：BRITE：预测的brite功能分类
第十八列：KEGG_TC
第十九列：CAZy：预测的碳水化合物活性酶
第二十列：BiGG_Reaction：BiGG代谢反应预测
第二十一列：PFAMs：pfam蛋白预测

我们了解整个注释文件的信息，如何来提取对应的数据集分析呢？

3.1 使用TBtols进行富集

1. 打开Tbtools中的eggNOG-mapper
   
2. 将注释文件拖拽进去
   
3. 输出结果
   
   输出文件，将注释ID与每个的GO ID或KEGG ID进行整理，直接生成一个背景文件信息，可以直接上传到云平台中进行分析。
   
   3.使用TBtools进行富集
   TBtools为什么受这么多人的欢迎，功能很强大。基本把你遇到的问题，都会提供解决。
   （1）下载.KEGG.BackEnd文件和go-basic.obo
   下载网址：

https://tbtools.cowtransfer.com/s/566e88227a0045

（2）运行
依次输入进行做好的注释文件和的差异基因即可进行富集

（3）结果
输出两个结果，一个是全部结果，另一个是过滤后的结果。

（4）绘制结果图形
绘制图形，可以根据自己的需求进绘制即可。

根据自己需求进行整理即可。

KEGG.data <- read.csv("KEGG_Enrichment_plotdata.csv", header = T)
names(KEGG.data) <- c("Term","ID","number", "Backgroundnumber","Richfactor","P_value", "Corr_PValue")
head(KEGG.data)
ggplot(KEGG.data, aes(x = number, y = Term))+geom_bar(stat = "identity", position = "dodge", color = "black")+xlab("Gene number")+ ylab("")+theme_classic()+theme(legend.title = element_blank())

ggplot(KEGG.data, aes(x = Richfactor, y = Term))+geom_point(aes(size = number, color = -1*log10(Corr_PValue)))+scale_color_gradient(low = "#0000ff", high = "#ff0033")+labs(color = expression(-log[10](PValue)), size = "Gene number", x = "Rich Factor", y = "", title = "KEGG Pathway Enrichment")+theme(legend.background = element_blank())+theme_bw()+ ## theme_bw() 去掉背景theme(axis.text = element_text(face = "bold",color = "black", size = 7)+## 修改字体大小，根据自己实际情况修改theme(axis.text = element_text(size = 12, family = "Arial", color = "black"),axis.title = element_text(size = 14, family = "Arial", color = "black"),legend.text = element_text(size = 12, family = "Arial", color = "black"),legend.title = element_text(size = 14, family = "Arial", color = "black"))  )

参考：

1. https://mp.weixin.qq.com/s/Ii-pB0JEDt_pRRKPyq3RLw
2. https://mp.weixin.qq.com/s/kIf6C2u3FID3ZeLtsB4eZQ

---

二、构建OrgDb数据库

我们上面的操作是将构建出来背景文件文件使用云平台或TBtools工具进行功能富集，那么若是使用clusterProfiler等包进行本地富集，就需要构建OrgDb数据库。

我们这里基于网上的教程资源，整理如何制作模式植物本地OrgDB数据库。在文末会标注的相关参考资源，在此也感谢各位知识分享博主的分享。

---

2.1 整理ggNOG-mapper注释文件

在注释文件中，会有很多列信息，我们可以做直接导入数据（PS：可能导入时会报错）。

emapper <- read.table("out.emapper_tomato.txt", header = T, sep = "\t")

若是报错，我们可以在本地提取相关的信息即可。我们所需的信息就只有ID，GO，KEGG信息列。

emapper <- read.csv("out.emapper_tomato.csv",header = T, check.names = F)

2.2 温馨提示

本教程，我们会提供分布式的步骤教程，大家可以直接跟随教程直接做即可。每个步骤，我们都会有详细的说明。此外，我们也会提供一步式教程，方便我们后期的制作 ，一步式教程，在我们的社群中可以查看。

模式植物本地OrgDb数据库制作

1. 导入相关的R包

library(clusterProfiler)
library(tidyverse)
library(stringr)
library(KEGGREST)
library(AnnotationForge)
library(clusterProfiler)
library(dplyr)
library(jsonlite)
library(purrr)
library(RCurl)

options(stringsAsFactors = F)

2. 导入数据

setwd("D:\\小杜的生信笔记\\2024\\20240802_模式植物构建OegDB数据库")
emapper <- read.csv("out.emapper_tomato.csv",header = T, check.names = F)
head(emapper)

将缺省值替换为NA

emapper[emapper==""]<-NA

3. 提取GO信息

gene_info <- emapper %>% dplyr::select(GID = query,GENENAME = Preferred_name) %>% na.omit()
gos <- emapper %>% dplyr::select(query, GOs) %>% na.omit()head(gos)

4. 构建空的gene2go数据框

gene2go = data.frame(GID =character(),GO = character(),EVIDENCE = character())

排顺整理，需要花费一定时间。

for (row in 1:nrow(gos)) {the_gid <- gos[row, "query"][[1]]the_gos <- str_split(gos[row,"GOs"], ",", simplify = FALSE)[[1]]df_temp <- data_frame(GID=rep(the_gid, length(the_gos)),GO = the_gos,EVIDENCE = rep("IEA", length(the_gos)))gene2go <- rbind(gene2go, df_temp)}

5. 删除NA行

gene2go$GO[gene2go$GO=="-"]<-NA
gene2go<-na.omit(gene2go)

---

6. 提取KEGG信息
   在这里，我们提取的是KO号列。

#把Emapper中的query列、KEGG_ko列提出出来
gene2ko <- emapper %>% dplyr::select(GID = query, Ko = KEGG_ko) %>% na.omit()
#将gene2ko的Ko列中的“Ko:”删除，不然后面找pathway会报错
gene2ko$Ko <- gsub("ko:","",gene2ko$Ko)head(gene2ko)

> head(gene2ko)GID            Ko
1 Solyc00g500001.1.1             -
2 Solyc00g500002.1.1             -
3 Solyc00g500003.1.1             -
4 Solyc00g500019.1.1             -
5 Solyc00g500020.1.1        K02634
6 Solyc00g500021.1.1 K02707,K02713

7. 下载KO的json文件，下载地址https://www.genome.jp/kegg-bin/get_htext?ko00001

下载后，放在路劲文件夹中。

8. 运行一下代码，本地创建kegg_info.RData文件

update_kegg <- function(json = "ko00001.json") {pathway2name <- tibble(Pathway = character(), Name = character())ko2pathway <- tibble(Ko = character(), Pathway = character())kegg <- fromJSON(json)for (a in seq_along(kegg[["children"]][["children"]])) {A <- kegg[["children"]][["name"]][[a]]for (b in seq_along(kegg[["children"]][["children"]][[a]][["children"]])) {B <- kegg[["children"]][["children"]][[a]][["name"]][[b]] for (c in seq_along(kegg[["children"]][["children"]][[a]][["children"]][[b]][["children"]])) {pathway_info <- kegg[["children"]][["children"]][[a]][["children"]][[b]][["name"]][[c]]pathway_id <- str_match(pathway_info, "ko[0-9]{5}")[1]pathway_name <- str_replace(pathway_info, " \\[PATH:ko[0-9]{5}\\]", "") %>% str_replace("[0-9]{5} ", "")pathway2name <- rbind(pathway2name, tibble(Pathway = pathway_id, Name = pathway_name))kos_info <- kegg[["children"]][["children"]][[a]][["children"]][[b]][["children"]][[c]][["name"]]kos <- str_match(kos_info, "K[0-9]*")[,1]ko2pathway <- rbind(ko2pathway, tibble(Ko = kos, Pathway = rep(pathway_id, length(kos))))}}}save(pathway2name, ko2pathway, file = "kegg_info.RData")}##'@本地创建kegg_info.RData文件
update_kegg()##'@载kegg_info.RData
load(file = "kegg_info.RData")

9. 根据gene2ko中的ko信息将ko2pathway中的pathway列提取出来

gene2pathway <- gene2ko  %>% left_join(ko2pathway,by = "Ko") %>% dplyr::select(GID, Pathway) %>% na.omit()

注意：在此步骤，可能会出现警告提示，大家忽略即可，不要以为是报错信息。

10. 在网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy上查询物种信息

** 进入网站：**

搜索物种

点进进去

获得相关信息

11. 填写对应信息

tax_id="4081"
genus="Solanum"
species="lycompersicum"

12. 去重

gene2go <- unique(gene2go)
gene2go <- gene2go[!duplicated(gene2go),]
gene2ko <- gene2ko[!duplicated(gene2ko),]
gene2pathway <- gene2pathway[!duplicated(gene2pathway),]

13. 构建OrgDb数据库

makeOrgPackage(gene_info=gene_info,go=gene2go,ko=gene2ko,pathway=gene2pathway,version="4.0",  #版本maintainer = "du<1678871583@qq.com>",  #修改为你的名字和邮箱author = "du<1678871583@qq.com>",  #修改为你的名字和邮箱outputDir = ".",  #输出文件位置tax_id=tax_id,genus=genus,species=species,goTable="go")

三、GO和KEGG富集分析

3.1 加载自建OrgDb数据库

install.packages("org.Slycompersicum.eg.db/", repos = NULL, type = "sources")

3.2 KEGG富集分析

1. 读取DEG_list

DEG_list <- read.csv("DEG_list.csv",header = F)gene_list <- DEG_list$V1

2. KEGG富集分析

pathway2gene <- AnnotationDbi::select(org.Slycompersicum.eg.db, keys = keys(org.Slycompersicum.eg.db), columns = c("Pathway","Ko")) %>%na.omit() %>%dplyr::select(Pathway, GID)

3. 导入 Pathway 与名称对应关系

load("kegg_info.RData")

kegg <- enricher(gene_list, TERM2GENE = pathway2gene, TERM2NAME = pathway2name, pvalueCutoff = 1, qvalueCutoff = 1,pAdjustMethod = "BH",minGSSize = 200)

4. 查看KEGG富集结果

kegg_results <- as.data.frame(kegg)
#
head(kegg_results)
##'@导出结果
write.csv(kegg_results,"./KEGG_output.csv")

5. 绘制柱状图

pdf("./功能富集/01.kegg.柱状图.pdf",height = 4, width = 6)
barplot(kegg, showCategory= 10,drop=F,color="pvalue", font.size=10) 
dev.off()

6. 气泡图

pdf("./功能富集/02.kegg.气泡图.pdf",height = 4, width = 6)
dotplot(kegg)
dev.off()

enrichplot::cnetplot(kegg,circular = F, colorEdge = T)

3.3 GO富集分析

enrich.go <- enrichGO(gene=gene_list,OrgDb = org.Slycompersicum.eg.db,# pvalueCutoff = 0.5,  ##'@结合自己的需求进行调整# qvalueCutoff = 0.5,  ##'@结合自己的需求进行调整pAdjustMethod = "BH",pvalueCutoff  = 0.05,ont = "ALL",  ## GO的种类，BP，CC， MF, ALLkeyType = "GID")

2. 查看GO富集结果

GO_results <- as.data.frame(enrich.go)
#
head(GO_results)
##'@导出结果
write.csv(kegg_results,"./GO_output.csv")

3. 绘制GO富集柱状图

pdf(file = "./功能富集/03.GO_bar.pdf", width = 8, height = 6)
barplot(enrich.go, drop = TRUE, showCategory = 10,   ## 显示前10个GO termsplit="ONTOLOGY") +scale_y_discrete(labels=function(x) str_wrap(x, width=80))+facet_grid(ONTOLOGY~., scale='free')
dev.off()

4. GO 气泡图

pdf(file = "./功能富集/04.GO_dotplot.pdf", width = 6, height = 6)
dotplot(enrich.go, showCategory = 10)
dev.off()

5. GO网络图

MF_ego <- enrichGO(gene  = gene_list,keyType = "GID",OrgDb   = org.Slycompersicum.eg.db,ont     = "MF", ##'@GO的种类，BP，CC，MFpAdjustMethod = "BH",pvalueCutoff  = 0.5  ##'@结合自己的需求进行调整
)

MF富集网络图

pdf("./功能富集/05.MF_网络图.pdf", width = 8, height = 8)
plotGOgraph(MF_ego)
dev.off()

MF_ego <- pairwise_termsim(MF_ego)
pdf("./功能富集/06.网络图.pdf",width = 8, height = 8)
emapplot(MF_ego, cex.params = list(category_label = 0.8, line = 0.5)) + scale_fill_continuous(low = "#e06663", high = "#327eba", name = "p.adjust",guide = guide_colorbar(reverse = TRUE, order=2), trans='log10')
dev.off()

参考资源：

1. https://www.jianshu.com/p/693d66681710
2. https://www.jianshu.com/p/bb4281e6604e
3. https://www.jianshu.com/p/9c9e97167377
4. https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/clusterProfiler/inst/doc/clusterProfiler.html#supported-organisms

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往期部分文章

1. 最全WGCNA教程（替换数据即可出全部结果与图形）

• WGCNA分析 | 全流程分析代码 | 代码一

• WGCNA分析 | 全流程分析代码 | 代码二

• WGCNA分析 | 全流程代码分享 | 代码三

• WGCNA分析 | 全流程分析代码 | 代码四

• WGCNA分析 | 全流程分析代码 | 代码五(最新版本)

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2. 精美图形绘制教程

• 精美图形绘制教程

3. 转录组分析教程

• 转录组上游分析教程[零基础]

• 一个转录组上游分析流程 | Hisat2-Stringtie

4. 转录组下游分析

• 批量做差异分析及图形绘制 | 基于DESeq2差异分析

• GO和KEGG富集分析

• 单基因GSEA富集分析

• 全基因集GSEA富集分析

小杜的生信筆記 ，主要发表或收录生物信息学教程，以及基于R分析和可视化（包括数据分析，图形绘制等）；分享感兴趣的文献和学习资料!!