经典RNA-seq分析流程1

RNA-seq分析有很多流程，

一般都是上游linux工具获取表达矩阵数据，然后就可以使用下游R包进行处理了，要么是差异DEG表达gene等分析；

因为下游分析其实R包是明确的，毕竟有很多生信分析教程，但是上游的linux如何获取gene表达矩阵，实际上工具就很多了，所以不同套件的工具组合成一个上游分析系列，就会有很多分析方式；

1，上游linux的比对+计数工具选取：

参考https://mp.weixin.qq.com/s/Ny2VYP-M9BxD2V8R5kkXaA

有两种方式比较推荐：

这种方式其实很常见：上游比对/回帖的工具，比如STAR、hisat2+下游计数的featureCounts

直接使用salmon进行定量，但是所谓的"clean fq"是什么，是指经过上游QC的fq文件吗？

另外新增一种方式：

常规QC——》STAR——》Salmon——》edgeR，

主要就是STAR+Salmon是他的linux上游分析工具；

总之例子很多，转录组分析工具是非常的多，可参考https://mp.weixin.qq.com/s/NUEi6oRFL7B3f1FpCD4Xug

下面采用2以及3的方式来处理常规RNA-seq：

（1）Salmon直接上游定量：

参考公众号：https://mp.weixin.qq.com/s/aDxnkK3jhyP6E_wfvza6jQ?search_click_id=11630710159653975537-1726118237844-0581657105

（以及下游的后续CSDN：https://blog.csdn.net/qazplm12_3/article/details/111056012?ops_request_misc=%257B%2522request%255Fid%2522%253A%25222FF4544C-25A8-44B0-8470-554470EF9883%2522%252C%2522scm%2522%253A%252220140713.130102334.pc%255Fblog.%2522%257D&request_id=2FF4544C-25A8-44B0-8470-554470EF9883&biz_id=0&utm_medium=distribute.pc_search_result.none-task-blog-2_blogfirst_rank_ecpm_v1~rank_v31_ecpm-3-111056012-null-null.nonecase&utm_term=salmon&spm=1018.2226.3001.4450）

基本等同于https://github.com/nattoh03/Salmon-Quant,

https://github.com/LauYuXuan/salmon_processing/blob/main/sh_salmon.sh,

https://github.com/bissessk/RNA-seq-Analysis-of-Control-and-NRDE2-depleted-Breast-Cancer-Cells/blob/master/1%20-%20Scripts%20and%20Commands/9_salmonQuantifySamples.sh

https://github.com/Alecrim24/Salmon_quant/blob/main/salmon%20on%20all%20reads%20mapped%20to%20the%20h.m%20genome

可以参考https://github.com/SamuelAMiller1/RNA-Seq_Analysis_salmon编写一个全程上游自动化的脚本

首先是下载salmon：

有很多方式，可以直接去salmon官网或者是github官网按照指示，

或者直接mamba search，也可以去bioconda寻找；

#构建索引index，从ucsc浏览器或者ENSEMBL下载参考基因组fa文件、基因注释gtf文件；假设为GRCh38.fa、GRCh38.gtf
#建议使用ensembl，最好是grch38也就是hg38
#这一块整个代码实际上就是参考https://combine-lab.github.io/alevin-tutorial/2019/selective-alignment/# 获取cDNA序列
gffread GRCh38.gtf -g GRCh38.fa -w GRCh38.transcript.fa.tmp# gffread生成的fasta文件同时包含基因名字和转录本名字
grep '>' GRCh38.transcript.fa.tmp | head# 去掉空格后面的字符串，保证cDNA文件中fasta序列的名字简洁，不然后续会出错
cut -f 1 -d ' ' GRCh38.transcript.fa.tmp >GRCh38.transcript.fa# 获取所有基因组序列的名字存储于decoy中
grep '^>' GRCh38.fa | cut -d ' ' -f 1 | sed 's/^>//g' >GRCh38.decoys.txt# 合并cDNA和基因组序列一起，注意：cDNA在前，基因组在后
cat GRCh38.transcript.fa GRCh38.fa >GRCh38_trans_genome.fa# 构建索引 （更慢，结果会更准）
salmon index -t GRCh38_trans_genome.fa -d GRCh38.decoys.txt -i GRCh38.salmon_sa_index

-d的文件（就是上图的decoy）加上整个到index步骤的代码块，都是参考https://combine-lab.github.io/alevin-tutorial/2019/selective-alignment/，也就是上面step1中代码块第3行的参考；

整体上上面大部分的代码是没有问题的，

就是-k参数，也就是k串，默认是31，但是我们在multiqc中实际上是可以知道我们二代测序的reads的长短的，所以可以根据上面这个指示进行修改-k参数，一般是改小。

step2：进行定量化，主salmon quant函数

实际执行过程中，参考官网https://salmon.readthedocs.io/en/latest/salmon.html
salmon有两种比对方式，就选其中使用reads的方法此处。因为：
salmon有2个模式mode：
1个是**mapping**-based mode，也就是先index再定量化，即直接对raw reads进行操作的此处（1）Salmon直接定量；

另外1个是alignment-based mode，可以接受STAR的比对/回帖，再Salmon定量化，也就是后面的（2）

因为我们是直接对reads进行定量化，所以此处选用mapping-based mode，

主要使用的参数：
-l A是对于raw reads定量而言的，亦即该模式；

–gcBias 都可以直接使用in any case

-p是线程数

官网推荐的这个参数已经弃用了

-g参数也就是前面step1中提供的gtf文件，只要提取其中的transcript_id以及gene_id两列即可，虽然官网中没有提示这个参数，所以

实际软件与官网提示不一定一致，看issue

其他的参数暂时就没有想到以及使用了，可以查看大多数人的经验缩小参数，然后看看是否必要设置；

当然，直接全部参数都去看才是最保险的！

反正就在这里https://salmon.readthedocs.io/en/latest/salmon.html

注意上游fq单端还是双端会有影响，分别编写了对应shell脚本salmon.sh、salmon_PE.sh、salmon_SE.sh，

**建议先对上游fq文件进行质控QC再执行salmon脚本！然后依据以前对于RNA-seq的处理经验，一般上游multiqc或者是fastqc的质控报告html中并不是所有的red flag error都需要修剪，一般只要trim_galore常规命令修剪，修剪之后依然error的一般不用太在意，因为RNA-seq的reads比较特殊，上游质控可以宽松点；