文献(5): 单细胞转录组揭示人类纤维化皮肤病中成纤维细胞的异质性

一句话评价：小样本量单细胞转录组在冷门疾病领域应用前景尚可，常规套路也能发NC

1. Title

标题可以看出本研究的主要内容：①构建成纤维细胞的图谱/揭示成纤维细胞的异质性；②找到一群（相对于正常样本）在纤维化皮肤病中含量升高的间充质成纤维细胞

2. Background

纤维化的特点是成纤维细胞增殖、迁移、侵袭能力增加以及胞外基质 (ECM) 的过度积累，在全球范围内都有较高的发病率和死亡率。纤维化皮肤病主要是 ECM 在真皮中积累
纤维化可影响任何器官，导致进行性组织瘢痕形成和器官功能障碍
迄今为止，纤维化皮肤病的发病机制尚未完全阐明，仍缺乏根治性治疗方法
尚缺乏关于 scRNA-seq 探索纤维化皮肤病成纤维细胞异质性的研究

——> 所以要做single cell

3. Results

3.1. 单细胞测序揭示正常伤疤和纤维皮肤病瘢痕的(真皮层)细胞异质性

keloid在此处表示瘢痕/“病灶”

都是很常见的图：

a.流程图，比一般情况多了酶解这一步，目的是消除表皮层的细胞
b.umap降维，展示cluster注释信息
c.层次聚类，表示cluster表达谱的相似性
d.各种细胞组分在每个样本中的占比

3.2 成纤维细胞被分为4群，其中间充质类型的成纤维细胞在疾病组织中增多

a, c, d, e. 在上一步的基础上，提取出成纤维细胞重新降维，聚类。结合已有文献，最终注释为4群，其中间充质成纤维细胞表达一些间充质祖细胞marker，如 COL11A1 和 POSTN，它们参与骨骼系统发育、骨化或成骨细胞分化。促炎成纤维细胞的特征包括炎症反应、细胞趋化性和胶原蛋白表达减少
f. 只有间充质类型的成纤维细胞(Mesenchymal fibroblasts,MF)在疾病组织中升高
h. 对比这种MF在疾病、正常之间的差异，发现疾病状态下，MF高表达骨骼系统发育、骨化相关通路和基因，比如COL11A1, COMP, POSTN

不知道大家读到这里有没有跟我一样的困惑：①某个细胞类型和其他细胞类型做对比，②这种细胞内部不同condition做对比，得到的差异基因和通路这么像？！

3.3 疾病组织中，间充质成纤维细胞的特征

（也就是在疾病组织中，将MF和其他成纤维细胞做对比）

b. 差异基因
d. 差异通路主要分了三块：胶原蛋白(ECM的成分)相关、伤口愈合相关、骨化相关
e. 这个图是看的转录调控，并没有采用常见的单细胞转录组中分析转录调控的方法。右边的小提琴表示TF在MF与the rest之间的表达差异。左边的图，每个TF对应一行，一行里面有两小行，列表示按照logFC排序后的基因，越往左表示MF中高表达的基因，越往右，表示the rest中高表达的基因。如果某个调控网络(TF加靶基因)在某个群中存在，则应该满足：TF高表达、TF正向调控的基因高表达、TF负向调控的基因低表达。以SCX为例，它在MF中高表达，它激活的基因(红色表示)在MF中高表达(因为这些基因排在左边)，它抑制的基因(蓝色表示)在MF中低表达(因为这些基因排在右边)，结合这几点共表达信息，就支持了MF中存在SCX的调控网络。通过这个分析，找到了MF中特有的调控网络，并和它上调的通路是吻合的。

荧光染色验证这群MF在疾病组织中存在，在正常组织中很少

3.4 细胞通讯分析

找到了疾病组织中显著的interaction
探究MF在细胞互作中所起的角色，MF有哪些重要的interaction

3.5 疾病真皮组织中MF通过POSTN促进胶原蛋白的表达

接着是做了一点点机制。关于为什么要做这个基因，正文没有说太多，只说是：①这个基因在MF中高表达；②此前已有一些报道称POSTN可以促进瘢痕组织的形成，可以促进胶原蛋白(一种ECM成分)的产生。

a. 通过单细胞转录组分析中得到的marker，将成纤维细胞分选为MF和other fibroblasts
d. 对这两组细胞做了bulk RNA-seq，证明分选效果比较好，得到了想要的细胞

g. 将两组细胞培养后，取上清液加到other fibroblasts里面，发现MF的上清液能使两种胶原蛋白表达升高
h. 加入POSTN的中和抗体后，这种现象被抑制了

通过一正一反的实验就证明了MF通过POSTN促进胶原蛋白表达的结论

3.6 MF的两个子类有什么关系

在3.2中，其实是把两个子类都归为MF了，这一部分就探究了它俩的关系。

a, b. diffusion map，这里只能看出降维信息，两类并不重合
c. mesenchymal progenitor marker genes在cS4中高表达(说明cS4可能是更早期的状态)
d. RNA velocity分析给出了几条可能的转化路径
f. 比较了cS4和cS1的差异，发现cS4更加具有间质特征

3.7 其他数据集也能发现这种MF细胞

a. 别人的数据集(硬皮症，也是一种纤维化皮肤病)的降维注释结果；本研究中某个正常样本数据集的降维注释结果
b, c. 提取上一步分析中两个数据集的成纤维细胞，整合，降维聚类
d. MF的marker基因在降维图中的投影，发现在cluster 7中，这些marker高表达，且疾病组织比正常组织高表达
e. cluster 7与本研究中4种成纤维细胞亚群的相关性热图，cluster 7和MF的相关性最高

结论是其他数据集也能找到这种MF，说明纤维化皮肤病存在一种广泛的致病机制

4. ref

Single-cell RNA-seq reveals fibroblast heterogeneity and increased mesenchymal fibroblasts in human fibrotic skin diseases

（2021.10.22组会分享的文献，因为准备时间有限，就选了这一篇较简单的）

我之前有想过一个问题，对于单细胞转录组数据，两组比较之后，如果已经找出有丰度差异的亚群，接下来的重点是： ①研究这一群的特征还是 ②比较这一群里面两组之间的差异我当时是觉得①更好，因为把这种亚群的特征研究清楚了，反映的就是组间差异（富含这种亚群的condition，也具有更明显的这种亚群的特征）。另一方面②中的比较，因为细胞注释是相同的，这样做可能得不出什么差异或者差异很小(假设虽然有丰度差异，但都有一定的细胞量)。

这篇文献的前半部分cluster之间以及condition之间的比较都得出相似的结果，跟我之前想的有点不一样...