Two BAHD Acyltransferases Catalyze the Last Step in the Shikonin/Alkannin Biosynthetic Pathway
两个BAHD酰基转移酶催化了紫草素/左旋紫草素生物合成途径中的最后一步
一个BAHD酰基转移酶专门催化紫草素的酰基化，而另一个BAHD酰基转移酶则仅催化紫草素的对映体左旋紫草素的酰基化，这种现象发生在紫草（Lithospermum erythrorhizon）中
摘要
一些紫草科植物会生成具有生物活性的红色萘醌类色素，这些色素是紫草素和左旋紫草素（对映异构体）的衍生物，其侧链上的酰基种类各不相同。不同植物种类中紫草素/左旋紫草素衍生物的组成存在差异，但关于形成这些衍生物多样性的机制尚不清楚。本研究从紫草（Lithospermum erythrorhizon）中鉴定并表征了两种BAHD酰基转移酶：紫草素O-酰基转移酶（LeSAT1）和左旋紫草素O-酰基转移酶（LeAAT1）。紫草是一种紫草科的药用植物，主要生成紫草素/左旋紫草素衍生物，如乙酰紫草素和β-羟异戊酰紫草素。通过使用大肠杆菌的酶活性检测发现，LeSAT1的酰基化活性特异于紫草素，而LeAAT1的酰基化活性特异于左旋紫草素。两种酶均能识别乙酰辅酶A（acetyl-CoA）、异丁酰辅酶A（isobutyryl-CoA）和异戊酰辅酶A（isovaleryl-CoA）作为酰基供体，生成对应的紫草素/左旋紫草素衍生物，其中两种酶对乙酰辅酶A表现出最高活性。这些发现与完整紫草植株和细胞培养中的紫草素/左旋紫草素衍生物组成一致。编码这两种酶的基因在黑暗中、以生产色素的M9培养基培养的根和细胞中表现出优先表达。这些结果表明，LeSAT1和LeAAT1是对映体特异性的酰基转移酶，可生成多种紫草素/左旋紫草素衍生物。
紫草素和左旋紫草素是一对红色萘醌类衍生物的对映体，是紫草科植物特有的次生代谢产物。这些衍生物具有多种生物活性，包括促进伤口愈合、抗菌、抗腺病毒和抗癌作用，因此生产这些衍生物的植物（如欧洲的紫草Alkanna tinctoria，东亚的紫草Lithospermum erythrorhizon和新疆紫草Arnebia euchroma）已被用作传统药材数百年。不同植物种类中紫草素/左旋紫草素衍生物的组成存在显著差异。例如，完整的紫草植株主要生成乙酰紫草素和β-羟异戊酰紫草素，而紫草A. tinctoria和新疆紫草A. euchroma主要生成β,β-二甲基丙烯基左旋紫草素，另一种中国紫草植物Onosma confertum则主要合成β,β-二甲基丙烯基紫草素和乙酰紫草素。此外，还分离出了许多含有不同支链酰基的衍生物。虽然不同植物来源的紫草素/左旋紫草素衍生物的生物活性已被报道有所差异，但其生物活性与酰基化形式及其分子构型之间的关系仍不明确。
在过去几十年中，已经建立了能够大量生产紫草素/左旋紫草素衍生物的紫草科植物细胞培养方法。这些细胞培养系统已被用于研究紫草素/左旋紫草素的生物合成途径。目前为止，已鉴定和表征了两个专门参与紫草素/左旋紫草素生物合成途径的酶。紫草中的对羟基苯甲酸香叶基转移酶（p-Hydroxybenzoic acid geranyltransferase）催化对羟基苯甲酸和香叶基焦磷酸（geranyl diphosphate）偶联生成间-香叶基-对羟基苯甲酸（m-geranyl-p-hydroxybenzoic acid），这是形成紫草素/左旋紫草素基本碳骨架的第一步。新疆紫草中的一种最近被报道的细胞色素P450酶（CYP76B74）催化香叶基氢醌（geranylhydroquinone, GHQ）在3″位的羟化反应，生成3″-羟基香叶基氢醌（GHQ-3′'-OH）。然而，在此步骤之后，催化环化反应形成萘醌结构的酶以及催化紫草素和左旋紫草素酰基化生成其多种衍生物的酶仍知之甚少。
紫草素/左旋紫草素衍生物的生物合成途径 虚线箭头表示尚未鉴定相关酶的反应步骤。本研究中鉴定了LeSAT1和LeAAT1。LePGT为紫草（L. erythrorhizon）中的对羟基苯甲酸香叶基转移酶。
为了鉴定和表征参与紫草素/左旋紫草素生物合成的特定基因和蛋白质，我们此前通过培养的紫草细胞进行了比较蛋白质组学分析，并鉴定了多个候选基因，包括酰基转移酶（Takanashi等，2019）。这些酰基转移酶属于BAHD酰基转移酶家族，该家族从各种酰基活化辅酶A硫酯供体中将酰基转移至受体分子（主要是酚类化合物），从而促进植物次生代谢产物的多样性（D’Auria，2006；Bontpart等，2015；Kusano等，2019）。
本研究报道了两种BAHD酰基转移酶的鉴定和表征，分别是紫草素O-酰基转移酶（LeSAT1）和左旋紫草素O-酰基转移酶（LeAAT1）。这两种酶分别催化紫草素或左旋紫草素的对映体特异性酰基化反应（图1）。底物特异性分析表明，两种酶均可将酰基从乙酰辅酶A（acetyl-CoA）、异丁酰辅酶A（isobutyryl-CoA）和异戊酰辅酶A（isovaleryl-CoA）转移到受体分子。我们的研究表明，LeSAT1和LeAAT1是生成多样化紫草素/左旋紫草素衍生物的关键酶。
结果
培养的紫草细胞中紫草素/左旋紫草素衍生物的手性组成及酰基化活性
紫草科（Boraginaceae）植物能够生成多种紫草素/左旋紫草素衍生物，其组成在不同植物种类之间、甚至同种植物的不同个体之间都有所差异。为了确定培养在M9培养基中的紫草细胞中紫草素/左旋紫草素衍生物的组成，研究采用了带手性柱的高效液相色谱（HPLC）分析。结果表明，最主要的化合物为乙酰紫草素（44.6%）和β-羟异戊酰紫草素（26.8%；见表1），其次是它们的对映体乙酰左旋紫草素（15.3%）和β-羟异戊酰左旋紫草素（5.7%）。还检测到其他紫草素衍生物，如异丁酰紫草素（3.7%）和异戊酰紫草素（0.8%）。这些结果表明，培养的紫草细胞主要生成紫草素而非左旋紫草素衍生物，这一结果与从完整的紫草植株和愈伤组织培养中获得的结果一致（Fukui等，1983；Zhou等，2011）。
Data are means ± sd of three independently prepared cultured cells.
| Compounds | Structures of Acyl Groups | Proportion |
|---|---|---|
| % | ||
| Acetylshikonin | OCOCH3 | 44.6 ± 2.7 |
| β-Hydroxyisovalerylshikonin | OCOCH2C(CH3)2OH | 26.8 ± 2.2 |
| Acetylalkannin | OCOCH3 | 15.3 ± 0.4 |
| β-Hydroxyisovalerylalkannin | OCOCH2C(CH3)2OH | 5.7 ± 0.3 |
| Isobutyrylshikonin | OCOCH(CH3)2 | 3.7 ± 0.5 |
| Isovalerylshikonin | OCOCH2CH(CH3)2 | 0.8 ± 0.1 |
为了表征培养的紫草（L. erythrorhizon）细胞无细胞提取物中的紫草素酰基化活性，进行了酶活性检测实验，将提取物与紫草素或左旋紫草素以及酰基供体乙酰辅酶A（acetyl-CoA）共同孵育（图2A）。结果显示，这些提取物对紫草素和左旋紫草素的乙酰化程度相当（图2B）。此外，培养的紫草细胞提取物还利用异丁酰辅酶A（isobutyryl-CoA）和异戊酰辅酶A（isovaleryl-CoA）作为酰基供体对紫草素和左旋紫草素进行酰基化（补充图S1）。这些结果表明，培养的紫草细胞至少含有一种具有广泛底物特异性的酰基转移酶，能够利用多种酰基供体，并以紫草素和左旋紫草素作为酰基受体。
通过手性HPLC分析培养的紫草（*L. erythrorhizon*）细胞脱盐无细胞提取物中的紫草素和左旋紫草素乙酰化活性 A、乙酰化反应示意图；B、乙酰化产物的HPLC色谱图。标注的化合物：1，紫草素；2，左旋紫草素；3，乙酰左旋紫草素；4，乙酰紫草素。
酰基转移酶基因的鉴定
我们之前对紫草的转录组和蛋白质组进行了比较分析，鉴定出四个在紫草素生产的培养细胞中表达的酰基转移酶候选基因（Takanashi等，2019）。其中三个候选基因（comp39163_c0_seq2、comp63127_c0_seq2和comp89737_c13_seq3）的表达在细胞培养于M9培养基并置于黑暗条件下时特异性诱导，此条件下可生成高水平的紫草素/左旋紫草素衍生物。而第四个候选基因（comp92813_c0_seq1）在M9培养基中培养的细胞中被检测到，无论是否有光照，此条件下紫草素/左旋紫草素的生产会被强烈抑制（补充图S2）。这四个候选基因属于BAHD酰基转移酶家族，该家族的酶能将酰基从多种酰基活化辅酶A硫酯供体转移至受体分子（D’Auria，2006）。 在这四个基因中，两个基因（comp63127_c0_seq2和comp92813_c0_seq1）具有超过1200bp的开放阅读框（ORF），这是BAHD酰基转移酶基因的平均长度，同时包含了III类BAHD酰基转移酶的五个保守基序（补充图S3；St-Pierre和De Luca，2000；Tuominen等，2011）。另外两个基因（comp39163_c0_seq2和comp89737_c13_seq3）分别缺失一个和两个保守基序。因此，对前两个基因（comp63127_c0_seq2和comp92813_c0_seq1）进行了克隆和进一步分析。
使用大肠杆菌的两种BAHD酰基转移酶的体外分析
通过异源表达系统在大肠杆菌中评估了这两个候选BAHD酶的酶活性。两个基因的编码序列经过优化以适应大肠杆菌的表达。由于comp63127_c0_seq2基因编码的重组蛋白在没有分子伴侣的情况下不可溶，因此共同表达了分子伴侣蛋白GroEL和GroES。在后续的镍亲和层析纯化中，由于comp63127_c0_seq2编码的重组蛋白与GroEL之间的强相互作用，两者一起被洗脱（补充图S4）。相比之下，comp92813_c0_seq1编码的蛋白表达不依赖于GroEL（补充图S4）。 使用乙酰辅酶A作为酰基供体，紫草素或左旋紫草素作为酰基受体，对这些蛋白的酶活性进行了评估。HPLC分析表明，comp63127_c0_seq2基因编码的酰基转移酶识别紫草素但不识别左旋紫草素作为受体底物，并生成乙酰紫草素作为唯一产物（图3）。相反，comp92813_c0_seq1基因编码的BAHD酰基转移酶识别左旋紫草素而不识别紫草素作为受体底物（图3）。这些结果表明，这两种BAHD酰基转移酶（分别命名为LeSAT1和LeAAT1）在紫草素/左旋紫草素衍生物的生物合成中具有不同的功能。
LeSAT1和LeAAT1对紫草素和左旋紫草素的立体特异性乙酰化反应（通过手性HPLC分析） LeSAT1催化紫草素的乙酰化，而LeAAT1催化左旋紫草素的乙酰化。标注的化合物：1，紫草素；2，左旋紫草素；3，乙酰左旋紫草素；4，乙酰紫草素。
为了研究LeSAT1和LeAAT1的底物特异性，分别将这两种酶与乙酰辅酶A（acetyl-CoA）和紫草素/左旋紫草素生物合成途径中的三个中间体（GHQ、GHQ-3″-OH和去氧紫草素）共同孵育（图1）。结果显示，这两种酶均未催化这些中间体的乙酰化反应。此外，还对LeSAT1和LeAAT1的酰基供体特异性进行了分析。LeSAT1能够以异丁酰辅酶A（isobutyryl-CoA）和异戊酰辅酶A（isovaleryl-CoA）作为酰基供体催化紫草素的酰基化，分别生成异丁酰紫草素和异戊酰紫草素，但无法以丙二酰辅酶A（malonyl-CoA）作为酰基供体（图4）。当使用异丁酰辅酶A和异戊酰辅酶A作为酰基供体时，LeSAT1的酶活性分别约为使用乙酰辅酶A时的三分之二和二分之一。对LeAAT1进行类似的分析发现，其使用左旋紫草素作为酰基受体的特异性表现与LeSAT1一致（图4）。这些结果与培养细胞中检测到的天然酶活性一致（补充图S1），并与紫草植物中最丰富的乙酰化紫草素/左旋紫草素衍生物的组成分布（表1）相吻合。
LeSAT1和LeAAT1的底物特异性分析 以紫草素和左旋紫草素分别作为酰基受体，两种酶的酰基化活性与供体酰基链的大小呈反比关系。N.D.表示未检测到活性。数据为三次技术重复的平均值±标准差（SD）。
这些底物特异性通过动力学分析进一步验证。LeSAT1和LeAAT1对其受体底物的表观亲和力（Km值）分别为159 μM和54 μM。当使用较短的酰基辅酶A（acyl-CoA）作为酰基供体时，两种酶的催化速率常数（kcat）均较高（表2）。LeAAT1对左旋紫草素的催化效率（kcat/Km）为12.7 mM⁻¹ s⁻¹，与III类BAHD酰基转移酶的报告值相似，例如，花红鼠尾草（Salvia splendens）中Ss5MaT2在合成单去丙二酸鼠尾草素（monodemalonylsalvianin）时的催化效率为13.5 mM⁻¹ s⁻¹（Suzuki等，2004），以及古柯树（Erythroxylum coca）中EcCS在合成甲基古柯碱（methylecgonine）时的催化效率为26.0 mM⁻¹ s⁻¹（Schmidt等，2015）。有趣的是，LeSAT1的催化效率仅为LeAAT1的约10%，这可能是由于在LeSAT1的酶制备中受分子伴侣蛋白的污染所致。这种污染导致表观蛋白浓度升高，同时由于存在非相关蛋白，使得酶活性的kcat值降低（补充图S4）。
对pH依赖性的研究表明，LeSAT1和LeAAT1的乙酰化活性在pH 5.0时达到最大，这是一个适度的酸性条件（图5）。
Data are means ± sd of three independently prepared samples with three technical replicates for each sample. Shikonin and alkannin were incubated with 0.25 mm of acetyl-CoA, and acyl-CoAs were incubated with 0.5 mm of shikonin or alkannin.
| Enzyme | Substrate | Product | K**m | kcat | kcat/K**m |
|---|---|---|---|---|---|
| µ**m | s**−1 | mm−1 s**−1 | |||
| LeSAT1 | Shikonin | Acetylshikonin | 159 ± 25 | 0.185 ± 0.031 | 1.23 ± 0.32 |
| Acetyl-CoA | Acetylshikonin | 53 ± 4 | 0.093 ± 0.017 | 1.77 ± 0.27 | |
| Isobutyryl-CoA | Isobutyrylshikonin | 78 ± 18 | 0.083 ± 0.018 | 1.07 ± 0.11 | |
| Isovaleryl-CoA | Isovalerylshikonin | 39 ± 5 | 0.048 ± 0.007 | 1.24 ± 0.13 | |
| LeAAT1 | Alkannin | Acetylalkannin | 54 ± 13 | 0.68 ± 0.27 | 12.7 ± 4.4 |
| Acetyl-CoA | Acetylalkannin | 92 ± 39 | 0.94 ± 0.30 | 11.9 ± 3.6 | |
| Isobutyryl-CoA | Isobutyrylalkannin | 116 ± 60 | 0.78 ± 0.30 | 7.87 ± 2.5 | |
| Isovaleryl-CoA | Isovalerylalkannin | 20 ± 7 | 0.14 ± 0.04 | 9.72 ± 4.1 |
乙酰化活性的pH依赖性 评估了LeSAT1（A）和LeAAT1（B）的酰基化活性。两种酶的乙酰化活性在pH 5.0时达到最大。数据为三次技术重复的平均值 ± 标准差（SD）。
LeSAT1和LeAAT1的器官特异性表达
通过提取完整紫草（L. erythrorhizon）植株的根、茎和叶，以及在三种不同生长条件下培养的细胞的总RNA，研究了LeSAT1和LeAAT1在完整植株和培养细胞中的表达谱。反转录定量PCR（RT-qPCR）分析表明，这两个基因在完整植株的根部和黑暗条件下M9培养基中培养的细胞中优先表达，在这些条件下紫草素/左旋紫草素衍生物的合成和积累达到最高水平（图6；Wu等，2017；Takanashi等，2019）。
为了评估各器官中的紫草素/左旋紫草素乙酰化活性，将根、茎和叶的无细胞提取物与紫草素或左旋紫草素在酰基供体乙酰辅酶A的存在下共同孵育。结果显示，乙酰化活性仅在根中检测到（补充图S5），这一结果与RT-qPCR分析一致（图6）。
LeSAT1和LeAAT1的器官特异性表达 通过RT-qPCR分析了LeSAT1和LeAAT1在三种不同组织和三种细胞培养条件下的表达情况，以GAPDH基因表达作为内参。结果表明，LeSAT1和LeAAT1特异性表达于紫草素/左旋紫草素衍生物高水平积累的组织和细胞中。数据为两组独立制备样品的三次技术重复的平均值 ± 标准差（SD）。
讨论
本研究鉴定了两种BAHD酰基转移酶，LeSAT1和LeAAT1，作为催化紫草（L. erythrorhizon）中紫草素/左旋紫草素生物合成途径最后一步的酶。LeSAT1将紫草素转化为乙酰紫草素，这是这些细胞中最丰富的紫草素衍生物；而LeAAT1参与乙酰左旋紫草素的生物合成，这是紫草中最丰富的左旋紫草素衍生物。
尽管培养的紫草细胞中紫草素和左旋紫草素衍生物的比例为8:2，但粗酶活性检测表明，紫草细胞几乎以相等的量生成紫草素和左旋紫草素衍生物。这些结果表明，紫草素和左旋紫草素衍生物的比例不是由紫草素或左旋紫草素的立体特异性酰基化决定的，而是由去氧紫草素的立体特异性羟基化决定的，这可能涉及两个独立的立体选择性羟化酶。
粗酶活性检测显示，酰基化活性与酰基辅酶A（acyl-CoA）的链长呈反比关系。这些结果与LeSAT1和LeAAT1的底物特异性相似，但相对使用异戊酰辅酶A的活性不同，表明可能有其他BAHD酰基转移酶参与紫草素/左旋紫草素衍生物的生物合成。RT-qPCR分析也支持这一观点，显示在黑暗条件下M9培养基中培养的细胞中，LeSAT1的相对表达量至少是LeAAT1的10倍。此外，粗酶活性检测显示紫草素和左旋紫草素的酰基化水平相似。不幸的是，由于LeSAT1在纯化过程中需要与分子伴侣蛋白GroEL共纯化，未能比较LeSAT1和LeAAT1的动力学参数。所有尝试去除GroEL的努力均未成功，包括在结合缓冲液中加入ATP以及在镍柱层析后使用离子交换树脂进行分离（补充图S4）。
紫草素/左旋紫草素衍生物在紫草细胞内合成，并积累于胞间隙中。电子显微镜和抑制剂处理的研究表明，这一分泌过程可能由囊泡介导的转运系统完成（Tsukada和Tabata，1984；Tatsumi等，2016）。使用14C标记的去氧紫草素和紫草素的研究表明，一个羟化酶和一个乙酰转移酶可以直接将去氧紫草素转化为乙酰紫草素，并与囊泡膜的定位协同进行（Okamoto等，1995）。由于BAHD酰基转移酶没有运输肽段或跨膜结构域，因此这些可溶性蛋白可能定位于细胞质中（D’Auria，2006）。在紫草细胞中，LeSAT1和LeAAT1可能与膜结合的羟化酶相互作用，形成一个称为代谢体（metabolon）的多酶复合体，可以直接将去氧紫草素转化为酰基化的紫草素/左旋紫草素衍生物。这类似于其他次生代谢产物生物合成途径，其中可溶性酶通过膜结合的细胞色素P450锚定（Mucha等，2019；Nakayama等，2019）。
培养的紫草细胞主要生成乙酰紫草素和β-羟异戊酰紫草素，同时还生物合成异丁酰紫草素和异戊酰紫草素。底物特异性分析显示，LeSAT1和LeAAT1在以乙酰辅酶A为酰基供体时活性最高，但也能接受异丁酰辅酶A和异戊酰辅酶A。这些发现表明，紫草中紫草素/左旋紫草素衍生物的多样性可能由LeSAT1和LeAAT1的底物特异性决定。紫草科植物的紫草素/左旋紫草素衍生物组成因植物种类而异（Fukui等，1983；Assimopoulou等，2006；Zhou等，2011）。研究LeSAT1和LeAAT1直系同源基因的底物特异性是否与其他紫草科植物中的紫草素/左旋紫草素衍生物组成相关将是一个有趣的方向。对新疆紫草（A. euchroma）和牛舌草（Echium plantagineum）等紫草科植物的最新组学研究可能有助于鉴定LeSAT1和LeAAT1的同源基因（Wang等，2014；Wu等，2017；Tang等，2020）。
LeSAT1和LeAAT1的氨基酸序列一致性为64%，且与参与番茄（Solanum lycopersicum）中酰基糖合成的BAHD酶（如SlASAT1、SlASAT2和SlASAT3）的氨基酸一致性为32%至36%（Schilmiller等，2015；Fan等，2016）。番茄中的酰基糖由四种BAHD酰基转移酶的连续酰基化反应合成。这些酶的酶活性在糖核心的酰基化位点和酰基供体的偏好上存在差异（Fan等，2016）。与栽培番茄中的同源基因相比，野生番茄物种（如Solanum pennellii、Solanum pimpinellifolium、Solanum galapagense等）中的这些同源基因在酰基化顺序和底物特异性上存在差异（Fan等，2017；Moghe等，2017；Nadakuduti等，2017），导致茄科植物中酰基糖结构的多样性（Fan等，2019）。对野生番茄及其相关物种的研究表明，参与酰基糖生物合成的BAHD酶起源于50至80百万年前的生物碱生物合成基因，并随后进化（Moghe等，2017）。对紫草科植物BAHD酰基转移酶的类似功能分析可能揭示其家族成员的起源及其负责紫草素/左旋紫草素衍生物多样性的分子进化过程。
夹竹桃科植物长春花（Catharanthus roseus）中的BAHD酰基转移酶也与LeSAT1和LeAAT1具有31%至38%的氨基酸一致性。长春花中参与单萜吲哚生物碱生物合成的两种BAHD酰基转移酶，CrMAT（Laflamme等，2001）和CrTAT（Carqueijeiro等，2018），被重新鉴定为对映体特异性酶（Williams等，2019），分别作用于(+)-vincadifformine和(-)-tabersonine的侧链羟基。分离的对映体特异性细胞色素P450也参与了CrMAT和CrTAT各自底物的生成（Williams等，2019）。这表明可能有单独的羟化酶作用于去氧紫草素，分别生成用于LeSAT1和LeAAT1反应的紫草素和左旋紫草素底物。
材料与方法
植物材料和化学试剂
紫草（Lithospermum erythrorhizon）植物在培养室中以23°C、16小时光照/8小时黑暗的光周期条件下生长约4个月。采集叶片、茎和主根，并储存于−80°C。紫草细胞培养按照Takanashi等（2019）的描述进行维护。GHQ按照Baeza等（2012）的方法合成，GHQ-3″-OH通过均一苯酸内酯合成，详细步骤见补充协议S1。紫草素、左旋紫草素及其衍生物从Nagara Science公司购买。乙酰辅酶A（acetyl-CoA）购自富士胶片和光化学（Fujifilm Wako），异丁酰辅酶A（isobutyryl-CoA）、异戊酰辅酶A（isovaleryl-CoA）和丙二酰辅酶A（malonyl-CoA）购自Sigma-Aldrich。
培养基中紫草素/左旋紫草素衍生物的检测
在改良的Murashige和Skoog培养基上生长的培养细胞被转移至M9培养基中以诱导紫草素/左旋紫草素的生产。在23°C、黑暗条件下于旋转摇床（80 rpm）上孵育2周后，从3 mL M9培养基中用等体积的乙酸乙酯提取紫草素/左旋紫草素衍生物。提取液经蒸发干燥后，用100 μL甲醇溶解，并以14,400g离心5分钟。取上清液，用Shimadzu公司的SPD-M20A系统（配备CHIRALPAK IH-3柱，内径4.6 mm×长度250 mm；Daicel）进行HPLC分析。分离条件为35°C、流速1.0 mL min⁻¹，采用60%（v/v）乙腈含0.4%（v/v）甲酸的等度洗脱。
粗酶提取物的制备（从培养细胞和完整植株中提取）
紫草细胞在M9培养基中培养2周，随后将液体石蜡覆盖在培养基上3天以去除紫草素/左旋紫草素衍生物。通过抽滤收集产色素的细胞，并储存于−80°C。为了制备无细胞提取物，将细胞和完整植株的各器官在含有以下成分的缓冲液中匀浆：2.5 mM乙酸、50 mM醋酸钠、100 mM氯化钠、10 mM二硫苏糖醇（DTT）、1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）、0.5%（w/v）抗坏血酸钠、1%（w/v）聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），pH 6.0。在10,000g下于4°C离心30分钟，将上清液通过棉漏斗过滤，再次离心，并用PD-10柱（GE Healthcare）脱盐。
LeSAT1和LeAAT1在大肠杆菌中的异源表达
LeSAT1和LeAAT1的全长开放阅读框（ORF）经过优化以适合在大肠杆菌中表达。将全长LeSAT1和LeAAT1用NdeI和SalI酶切后，克隆至pCold I载体（Takara Bio）的NdeI/SalI位点。这些构建体用于转化大肠杆菌Origami菌株。为了表达LeSAT1，使用共表达分子伴侣GroEL和GroES的pGro7质粒（Takara Bio）进行共转化。转化子在300 mL裂解原培养基（lysogeny broth medium）中以37°C培养。当OD600达到0.6至0.8时，通过在冰上冷休克30分钟并添加1 mM异丙基-β-d-1-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达，随后在15°C下进一步培养12至24小时。
蛋白提取与纯化（从大肠杆菌中表达的LeSAT1和LeAAT1）
以下所有步骤均在约4°C下进行。收获的细胞在裂解缓冲液中进行超声破碎，裂解缓冲液包含50 mM Tris-HCl（pH 7.6）、5%（v/v）甘油、20 mM MgCl₂和1%（v/v）TWEEN 20。细胞碎片通过10,000g离心20分钟去除。将上清液加载到含有2 mL镍树脂（Ni Sepharose 6 Fast Flow；GE Healthcare）的亲和柱上。对于LeSAT1的纯化，使用含50 mM Tris-HCl（pH 7.6）、10%（v/v）甘油、500 mM NaCl和20 mM咪唑的结合缓冲液清洗两次4 mL。对于LeAAT1，将咪唑浓度调整为50 mM。带有His标签的LeSAT1或LeAAT1通过含50 mM Tris-HCl（pH 7.6）、10%（v/v）甘油、500 mM NaCl和500 mM咪唑的洗脱缓冲液进行四次2 mL的洗脱。对于LeSAT1的纯化，在结合缓冲液中补充10 mM ATP，并将柱子在室温下孵育1小时后进行洗脱。纯化的酶组分通过含50 mM MES（pH 6.5）的PD-10柱脱盐，用于后续的酶活性检测。
酶活性检测
酶活性检测在含50 mM MES（pH 5.5，50 μL）的反应体系中进行，反应体系中包含10 mM抗坏血酸钠、0.3%（v/v）Triton-X、酶组分（25 μL）和底物（250 μM酰基供体和500 μM酰基受体）。在30°C孵育5分钟后，用50 μL乙酸乙酯提取反应产物，并以14,400g离心5分钟。取上清液并使用CHIRALPAK IH-3柱（Daicel）的HPLC进行分析（如前所述）。乙酰化活性的最佳pH值通过包含3,3′-二甲基戊二酸、Tris和2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇的缓冲液进行确定。紫草素和左旋紫草素（每种2.5–250 μM）以及酰基辅酶A（2.5–500 μM）的动力学参数通过分别使用250 μM乙酰辅酶A和500 μM紫草素或左旋紫草素测定。
RNA提取与RT-qPCR分析
使用RNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）或ISOSPIN Plant RNA（Nippon Gene）从培养细胞和完整植株中提取总RNA。经DNase I处理后，将总RNA使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix（Toyobo）逆转录。RT-qPCR通过KOD SYBR qPCR Mix（Toyobo）和基因特异性引物（补充表S1）在StepOnePlus实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific）上进行。每个样本的基因表达水平相对于内参基因GAPDH mRNA进行标准化，使用2−ΔΔCt方法（Livak和Schmittgen，2001）结合标准曲线法计算（Larionov等，2005）。
登录号
本文涉及的序列数据可从日本DNA数据库（DDBJ）获取，登录号为LC520137（LeSAT1）和LC520138（LeAAT1）。
