乳腺癌是全球最常见的癌症，也是全球女性癌症相关死亡的主要原因。根据雌激素和孕激素受体以及人类表皮生长因子受体 2 (HER2) 的表达，乳腺癌可分为激素受体阳性、HER2 阳性或三阴性乳腺癌 (TNBC)。在主要亚型中，TNBC 的远处转移风险最高，预后最差。约 30% 的转移性 TNBC 患者出现脑转移，总生存期最短。KMT2C和KMT2D是编码组蛋白H3赖氨酸4(H3K4)甲基转移酶的基因，在TNBC中突变频率最高，但这些突变如何影响表观基因组和转录组以促进肿瘤发生尚不清楚。

2024年6月26日，来自美国丹娜-法伯癌症研究所的Kornelia Polyak团队在Nature Cell Biology上在线发表了文章Loss of Kmt2c or Kmt2d drives brain metastasis via KDM6A-dependent upregulation of MMP3，发现在非转移性TNBC小鼠模型中，Kmt2c或Kmt2d的缺失会导致转移（尤其是脑转移），揭示了KMT2C或KMT2D缺失通过KDM6A依赖的方式促进MMP3的表达，从而驱动TNBC的脑转移的新机制，不仅在表观遗传层面为TNBC的治疗提供了新的视角，也为开发针对脑转移的靶向治疗策略提供了潜在靶点。

「  研究路线  」

「  研究结果  」

01 

缺乏Kmt2c/Kmt2d会导致转移

KMT2C和KMT2D是三阴性乳腺癌(TNBC)中频繁突变的基因，分别在8.0%和8.7%的肿瘤中检测到突变。这些突变大多数为截短或错义突变，暗示功能丧失。与匹配的原发性TNBC相比，KMT2C和KMT2D在远处转移中的表达显著降低(Fig.1a )，提示它们的功能丧失可能与转移有关。

为了探究Kmt2c/ Kmt2d基因缺失的后果，研究者们通过转染带有mCherry标签的sgRNA库和表达Cas9及绿色荧光蛋白(GFP)的质粒，在非转移性的168FARN和67NR小鼠乳腺肿瘤细胞系中敲除了这些基因(Fig.1b)。敲除效率通过测序得到验证，并通过免疫印迹分析确认了蛋白表达的减少(Fig.1c)。通过将168FARN细胞与H2B-mCherry共转染后注入免疫健全的BALB/c雌鼠的乳腺脂肪层(MFPs)中(Fig.1d)，研究发现Kmt2c或Kmt2d的缺失并未显著影响原发肿瘤的生长(Fig.1e)，但在敲除细胞而非野生型(WT)细胞注射的小鼠的肝脏、肺和大脑中检测到了mCherry+的微小转移灶(Fig.1f,g)。通过心脏内注射和流式细胞术进行的定量转移评估显示，敲除细胞在小鼠大脑中有显著富集，但在肝脏或肺组织中没有(Fig.1h,i)。此外，H&E染色和股骨切片分析证实了在Kmt2c和Kmt2d KO组中观察到的多器官转移表型(Fig.1j)。这些结果表明Kmt2c或Kmt2d的缺失赋予了肿瘤细胞多器官转移的能力。

Fig1.Kmt2c或Kmt2d的缺失会诱导多器官转移

02 

Kmt2c KO和Kmt2d KO特异性肿瘤免疫微环境

研究发现Kmt2c和Kmt2d 的缺失可能会影响肿瘤细胞对免疫检查点抑制剂的敏感性，并通过scRNA-seq分析了这些基因敲除（KO）肿瘤细胞与野生型（WT）肿瘤细胞在免疫微环境中的差异(Fig.2a)。Kmt2c KO和Kmt2d  KO肿瘤细胞表现出与WT细胞不同的基因表达模式(Fig.2b,c)，表现出几种免疫检查点基因上调(Fig.2d,e)，尤其是程序性死亡配体1（PD-L1）(Fig.2f,g)。免疫微环境中，Kmt2c KO和Kmt2d  KO肿瘤中，免疫抑制性T调节细胞的标记较高，而CD8+ T细胞在Kmt2c KO中比例上升且显示出较高的耗竭趋势(Fig.2h-n)。免疫荧光证实，在Kmt2c KO肿瘤中，特别是CD8+ T细胞的数量显著多于WT（Fig.2o,p）。此外，KO肿瘤中某些吸引免疫细胞的因子也上调。在免疫缺陷小鼠模型中，Kmt2c或Kmt2d 的缺失并未直接导致主要的免疫抑制(Fig.2q)，表明它们的缺失可能不是转移的主要驱动因素。

Fig 2.Kmt2c和Kmt2d缺失对肿瘤免疫微环境的不同影响

03 

Kmt2c KO和Kmt2d KO会改变染色质状态和转录本表达

为了解析KMT2C或KMT2D基因丢失诱导的细胞内在变化，研究者深入探究了KMT2C和KMT2D两种组蛋白甲基转移酶基因敲除（KO）对细胞组蛋白修饰的影响。定量组蛋白质谱分析显示，与野生型（WT）细胞相比，两种KO细胞的组蛋白修饰模式相似(Fig.3a)，但H3K4me1和H3K27me3在Kmt2c KO细胞中显著减少，但在Kmt2d KO细胞中没有减少，而H3K27ac则在2种KO细胞系中都显著增加(Fig.3b)。免疫印迹分析显示H3K4me1水平相似，但在两种KO细胞系中H3K27me3减少，H3K27ac增加(Fig.3c)。此外，通过ChIP-seq技术，研究者观察到Kmt2c KO和Kmt2d KO细胞中H3K4me1和H3K27ac的峰值出现显著的增加或减少，而H3K27me3的峰值变化不大。这些变化是局部的而非全局性的，并且每种KO细胞的变化具有独特性(Fig.3e,f,g)。由于KMT2C和KMT2D是H3K4的甲基转移酶，但H3K27ac的增加可能是由于这些酶活性丧失的间接效应。P300，一种H3K27乙酰转移酶，其信号强度与H3K27ac的变化显著相关，表明P300可能在KO细胞中调节H3K27ac的水平(Fig.3i)。同时，KDM6A，一种H3K27me3的去甲基化酶，其ChIP-seq结果显示KO细胞中KDM6A峰值显著增加，但与H3K27ac的增加重叠较少 (Fig.3j)，两种KO细胞系之间增加的独特的KDM6A峰值多于共有的(Fig.3k)，这可能影响H3K27me3的水平。

Fig 3.Kmt2c KO和Kmt2d KO细胞中组蛋白和KDM6A占用的改变

然后，研究者对Kmt2c KO和Kmt2d KO细胞进行了RNA-seq分析，并与野生型（WT）相比识别了差异表达基因（DGEs）(Fig.4a)。在两种KO细胞系之间的DGEs独特性多于共享性(Fig.4b)，但都影响了上皮-间充质转换（EMT）的平衡。值得一提的是，即使在没有EMT的情况下，也能观察到Kmt2c和Kmt2d缺失促进转移的作用。为了评估染色质变化对转录组的影响，研究者使用结合与表达靶标分析（BETA）整合了RNA-seq和ChIP-seq数据。增加的H3K4me1、H3K27ac和KDM6A峰值与Kmt2c KO和Kmt2d KO细胞中上调的基因显著相关，而丢失的H3K4me1和H3K27ac峰值与下调的基因显著相关(Fig.4c)。最后，研究者重叠了在Kmt2c KO或Kmt2d KO细胞中BETAs上调相关性基因。最大的基因集在所有三种BETAs中共享，表明H3K4me1、H3K27ac和KDM6A对目标基因的调控相似（图4d）。这些结果提示KMT2C/D的缺失可通过影响染色质状态来调控基因表达，进而可能影响肿瘤的转移，而KDM6A可能是KMT2C/D缺失相关转录组变化的介质。

Fig4.KDM6A和组蛋白重塑与Kmt2c KO和Kmt2d KO的转录组学变化相关

04 

阻断KDM6A通过降低Mmp3来减少脑转移

为了识别Kmt2c KO和Kmt2d KO细胞转移表型的共同表观遗传调控因子，研究者整合了显著增加的H3K4me1和H3K27ac peaks以及在癌细胞的RNA-seq和scRNA-seq中显著上调的基因，鉴定出基质金属蛋白酶3 (Mmp3)是唯一重叠的基因(Fig.5a)。研究者确认了Mmp3位点上富集的H3K4me1和H3K27ac信号强度(Fig.5b)，并发现两种168FARN和67NR KO衍生细胞中显著上调了Mmp3表达(Fig.5c,d)。更重要的是，在具有KMT2C突变的人类三阴性乳腺癌（TNBC）中，MMP3表达显著高于WT肿瘤，并且MMP3高表达的肿瘤具有显著更高的KMT2C突变频率(Fig.5e)。

为了在功能上表征Mmp3，研究者在168FARN Kmt2c KO、Kmt2d KO、WT细胞中使用shRNA下调其表达。将细胞注入小鼠心内，用流式细胞术定量转移细胞，结果显示Mmp3下调可显著降低Kmt2c KO和Kmt2d KO细胞的脑转移(图5f,g)。先前的临床试验表明，MMP抑制剂毒性高，疗效低。然而，本文的数据表明，KDM6A可能是Kmt2c和Kmt2d损失相关转录组变化的中介(Fig.3c,d)；因此，抑制KDM6A可能是一种间接靶向MMP3的途径。

Fig5.Mmp3驱动Kmt2c KO和Kmt2d KO细胞脑转移

研究者构建了168FARN Kmt2c和Kmt2d表达kdm6a靶向shRNAs的KO和WT细胞，结果显示Kdm6a下调导致Mmp3表达显著降低(Fig.6a)， Kmt2c KO和Kmt2d KO细胞脑转移显著减少(Fig.6b,c)。使用KDM6A、KDM1A和P300的抑制剂处理细胞，发现KDM6A抑制剂GSK-J4能够降低H3K27ac的水平，进而显著减少两种KO细胞系中Mmp3的表达(Fig.6d)。此外，P300的抑制也特异性地在KO细胞中减少了Mmp3的表达(Fig.6e)。通过ChIP-seq数据分析，研究者发现Kmt2c KO和Kmt2d KO细胞中Mmp3启动子区域的H3K27me3水平降低，P300水平升高，而KDM6A的水平并没有一致变化，表明KDM6A可能不是通过直接结合启动子来调控Mmp3的表达。研究者还观察到MMP基因簇中的多个成员在KO细胞中表达上调，并通过抑制KDM6A或P300来降低这些基因的表达，这支持了KDM6A在远程调控元件中发挥作用。最后，研究者评估了KDM6A抑制剂GSK-J4在预防脑转移方面的治疗潜力。通过在小鼠模型中预处理细胞和体内给药，发现GSK-J4治疗显著减少了Kmt2c KO和Kmt2d KO细胞在小鼠大脑中的转移，而对骨转移的影响不大(Fig.6f)。这些结果表明通过靶向 KDM6A 间接抑制 MMP3 可防止KMT2C或KMT2D突变肿瘤的转移。

Fig6.抑制KDM6A可降低Kmt2c KO和Kmt2d KO诱导的Mmp3表达和脑转移

综上所述，本研究阐明了KMT2C/D突变导致的染色质重塑和组蛋白修饰变化，通过KDM6A间接影响MMP3的表达，从而诱导TNBC远端转移的分子机制。同时证明通过抑制KDM6A的活性，可以减少MMP3的表达，并可预防由KMT2C/D突变引起的脑转移(Fig.6g)，不仅增进了人们对TNBC转移机制的理解，也为开发新的治疗策略提供了有价值的信息。