优化大肠杆菌菌株和发酵工艺以提高L-赖氨酸生产-文献精读94

Optimizing Escherichia coli strains and fermentation processes for enhanced L-lysine production: a review

优化大肠杆菌菌株和发酵工艺以提高L-赖氨酸生产：综述

对比酵母酵母中de novo生物合成啤酒花活性类黄酮黄腐醇-文献精读93-CSDN博客

赖氨酸是一种重要的必需氨基酸，具有广泛的应用价值，被广泛用于食品、饲料和医药工业。为了满足日益增长的需求，微生物发酵已成为一种有效且可持续的L-赖氨酸生产方法。由于其快速生长、易于基因改造以及高生产效率，大肠杆菌已成为工业L-赖氨酸生产的主要微生物之一。本文综述了大肠杆菌菌株工程和发酵工艺优化在L-赖氨酸生产中的最新进展。此外，还讨论了基于大肠杆菌的L-赖氨酸生产中潜在的技术突破和挑战，并为支持工业化规模生产提供未来研究方向。

1 引言

L-赖氨酸是一种必需氨基酸，在动物和人类的生长发育中起着至关重要的作用，特别是在蛋白质合成、骨骼发育、免疫功能和激素生成中（Matthews, 2020）。由于动物无法自行合成赖氨酸，必须通过饮食或补充剂获取，因此L-赖氨酸在畜牧业中作为饲料添加剂尤为重要（Bampidis et al., 2022）。此外，赖氨酸还广泛应用于食品加工和医药领域，例如生产健康产品、药物和营养补充剂（Cheng et al., 2018；Pandey et al., 2020）。2021年，全球赖氨酸市场价值69.6亿美元，预计到2030年将达到123.8亿美元，复合年增长率为6.5%（Leinonen et al., 2019）。全球对L-赖氨酸的持续增长需求主要受到肉类消费增加和高蛋白食品需求上升的推动（Wang L. et al., 2021）。根据市场研究，赖氨酸市场的增长主要集中在亚太地区、北美和欧洲，尤其是在畜牧业发达的地区需求强劲（Parisi et al., 2020）。近年来，为满足市场对环保和可持续发展的要求，赖氨酸生产逐渐从传统的化学合成方法转向生物发酵方法（He et al., 2024；Félix et al., 2019）。

在工业生产中，L-赖氨酸主要通过微生物发酵生产（Ikeda, 2017）。微生物发酵用于L-赖氨酸生产具有多方面的优势：首先，这种方法利用微生物的代谢途径，通过发酵过程高效合成L-赖氨酸，从而实现高生产效率；其次，发酵方法相对环保，减少了化学合成过程中的潜在污染物；再次，微生物发酵可以使用可再生资源作为原料，从而降低生产成本；最后，通过基因工程技术，可以进一步优化微生物菌株以提高L-赖氨酸的产量和纯度（Anaya-Reza和Lopez-Arenas, 2017；D'Este et al., 2018）。这些优势使微生物发酵成为L-赖氨酸生产的首选方法，不仅带来了显著的经济效益，同时也满足了现代工业对环境保护和可持续发展的要求。

用于L-赖氨酸生产的微生物发酵的主要菌株包括大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌和黄短杆菌。在这些菌株中，由于其遗传背景明确、基因编辑工具丰富以及生长周期短，大肠杆菌已成为L-赖氨酸生产的主要优势菌株（Mir et al., 2024；Chen et al., 2013）。表1展示了在大肠杆菌中生产L-赖氨酸的不同方法。

表 1. 不同方法在大肠杆菌中用于生产L-赖氨酸

近年来，大肠杆菌L-赖氨酸生产菌株的诱变育种取得了显著进展（Tadepally, 2019）。通过物理、化学和生物诱变方法，研究人员能够在大肠杆菌中诱导基因突变，并筛选出高产赖氨酸的突变体。常见的诱变方法包括紫外线（UV）照射以及化学诱变剂（如亚硝基胍，NTG）的应用（Wang J. et al., 2021; Xu Z. et al., 2016）。高通量筛选技术可以快速鉴定出高产赖氨酸的突变株（Zeng et al., 2020; Kaczmarek and Prather, 2021）。随着代谢组学、转录组学等技术的发展，诱变育种的效率不断提高，使研究人员能够更准确地分析和筛选具有理想特性的突变株。然而，由于诱变的随机性，诱变育种通常与基因工程相结合，以进一步优化菌株性能（Chen et al., 2023）。

基因工程育种在改良大肠杆菌L-赖氨酸生产能力方面发挥着越来越重要的作用（Xu et al., 2015）。通过基因编辑、代谢工程和合成生物学技术，研究人员可以精确修改大肠杆菌的代谢途径，以增强其赖氨酸生产能力（Liu et al., 2022）。常见的策略包括关键酶基因的过表达、竞争性代谢通路的敲除，以及转录调控网络的优化（Dasgupta et al., 2020）。利用CRISPR-Cas9等基因编辑技术，科学家可以同时修改多个基因，从而实现代谢网络的全局优化（Wu et al., 2020）。基因工程育种已被应用于工业生产中，显著提高了赖氨酸的生产效率。未来，通过整合机器学习和代谢建模等智能方法，基因工程育种有望进一步提高赖氨酸生产的效率与自动化水平（Xu et al., 2020）。

优化赖氨酸生产大肠杆菌的发酵工艺是提高生产效率的重要一步。目前的研究主要集中在培养基成分、发酵参数和过程控制方面（Du Y. H. et al., 2022）。通过优化培养基中的碳氮比、微量元素和维生素，可以显著提高大肠杆菌的生长速率和赖氨酸的生产量（Hao et al., 2020）。此外，在发酵过程中控制温度、pH值和溶解氧水平，可以有效维持大肠杆菌的代谢活性并减少副产物的生成（Wang et al., 2018）。同时，连续发酵和分批补料发酵等新型发酵工艺在工业生产中取得了积极成效，延长了发酵时间并增加了赖氨酸的积累量。近年来，智能发酵系统逐渐兴起，通过传感器和自动化控制技术实现发酵过程的实时监控和动态调整，进一步提高了生产效率和工艺稳定性（Egbune et al., 2024; Chen T. et al., 2019）。这些进展为大肠杆菌赖氨酸的大规模工业化生产奠定了重要基础。

本文综述了通过菌株工程和发酵优化提高大肠杆菌L-赖氨酸生产的研究进展，同时重点介绍了用于大肠杆菌L-赖氨酸生产的新策略以及由L-赖氨酸衍生的各种增值化学品。本文为通过系统生物学和生物工艺工程的创新进一步提高L-赖氨酸产量提供了未来的研究方向。

2 菌株改造

2.1 传统诱变育种

大肠杆菌L-赖氨酸生产的诱变育种始于20世纪中期，当时科学家开始使用物理和化学诱变剂，如紫外线（UV）辐射、X射线和N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍（NTG），对大肠杆菌进行遗传突变诱导，以筛选出赖氨酸生产能力增强的菌株（Nakamori, 2017）。早期应用这种方法成功开发出多个具有工业价值的突变体，显著提高了L-赖氨酸的生产能力。例如，通过使用NTG对大肠杆菌进行诱变，研究人员筛选出了赖氨酸营养缺陷型菌株（Lys-），并通过青霉素富集法消除野生型菌株（Choi et al., 2016）。此外，UV和乙基甲磺酸酯（EMS）诱变（单独或联合）也被用于筛选赖氨酸营养缺陷型突变体，从而优化了诱变条件（Liu and Jiang, 2015）。随着技术的进步，特别是结合现代高通量筛选技术，诱变育种的效率进一步提高，使研究人员能够更快地识别出优良突变体。这使得这种传统育种方法得以继续在L-赖氨酸生产中应用（Wang et al., 2012）。

目前，关于大肠杆菌L-赖氨酸生产菌株诱变育种的研究仍在继续，重点是提高诱变效率、筛选高产突变株，并通过代谢流分析进一步优化突变体的代谢途径（Hirasawa and Shimizu, 2016）。尽管诱变育种具有随机性和不可预测性，但其简单性、易实施性和低成本使其成为工业微生物育种的重要工具（Li et al., 2022; Sanghavi et al., 2020）。未来，随着基因组编辑技术和系统生物学的发展，诱变育种有望与精准的基因工程方法（如CRISPR-Cas9）相结合，实现更高效的定向诱变，并进一步提高L-赖氨酸的生产。此外，GREACE方法（基因组复制工程辅助连续进化）是一种用于增强微生物耐受性和生产能力的进化工程方法（Lee and Kim, 2020）。该方法的核心原理是引入DNA聚合酶复合物的校对缺陷突变体，从而在体内促进连续突变，加速进化过程。在实际应用中，GREACE方法采用“诱变与选择结合”的策略，在应激条件下快速筛选出具有优良表型的菌株（Zhao et al., 2022; Luan et al., 2013）。例如，在提高L-赖氨酸生产的研究中，利用GREACE方法改造的E. coli RS3菌株在5升发酵罐中实现了155.0 g/L的最终产量，葡萄糖转化率为0.59 g/g，总产量达到605.6 g（Wang et al., 2019）。这种整合了传统与现代技术的育种策略将为大肠杆菌在L-赖氨酸生产中的工业应用提供新方向（Nakamori, 2017）。

2.2 基因工程育种

菌株的基因工程是一个综合性的过程，包括特定基因的敲除、定向突变、关键酶基因的过表达以及代谢通路的改造。通过精确的修改和优化，可以显著提升大肠杆菌的赖氨酸生产能力，从而为工业生产提供高效、稳定的菌株资源（Leong et al., 2020）。

2.2.1 大肠杆菌中赖氨酸的生物合成途径

大肠杆菌赖氨酸生产的基因组改造策略主要基于其赖氨酸的生物合成途径（图1）。赖氨酸的合成以L-天冬氨酸（L-aspartate）为起点，天冬氨酸由草酰乙酸（oxaloacetate）在天冬氨酸氨基转移酶（AST）的催化下生成。草酰乙酸是三羧酸（TCA）循环中的一个关键中间体。在天冬氨酸激酶（AK）的催化下，L-天冬氨酸首先与ATP反应生成L-4-天冬氨酰磷酸，这是天冬氨酸途径中的一个重要起始步骤。

随后，L-4-天冬氨酰磷酸经过一系列酶促反应转化为L-天冬氨酸-4-半醛。L-天冬氨酸-4-半醛在二氢二吡啶酸合酶（DHDPS）的催化下生成L-2,3-二氢二吡啶酸，这是赖氨酸生物合成的一个关键中间体。L-2,3-二氢二吡啶酸接下来由二氢二吡啶酸还原酶（DHDPR）还原为四氢二吡啶酸。经过一系列酶促反应，四氢二吡啶酸最终被转化为中间产物间-2,6-二氨基哌啶酸（meso-2,6-diaminopimelate, DAP）。

此过程中涉及若干关键酶，包括DAP氨基转移酶和DAP脱羧酶。最后，DAP脱羧酶催化间-2,6-二氨基哌啶酸转化为L-赖氨酸，从而完成赖氨酸的生物合成。

2.2 基因工程育种

基因工程育种是一个综合性过程，包括特定基因的敲除、定向突变、关键酶基因的过表达以及代谢途径的改造。通过精确的修改和优化，可以显著提高大肠杆菌的赖氨酸生产能力，为工业生产提供高效且稳定的菌株资源（Leong et al., 2020）。

2.2.1 大肠杆菌赖氨酸的生物合成途径

大肠杆菌赖氨酸生产的基因组改造策略主要基于其赖氨酸的生物合成途径（图1）。在大肠杆菌中，有六种与赖氨酸合成相关的酶：

天冬氨酸半醛脱氢酶（ASADH，编码基因为 asd）；
天冬氨酸激酶（AK，编码基因为 lysC）；
二氢吡啶二羧酸还原酶（DHDPR，编码基因为 dapB）；
二氢吡啶二羧酸合酶（DHDPS，编码基因为 dapA）；
二氨基哌啶酸脱羧酶（DAPDC，编码基因为 lysA）；
二氨基哌啶酸脱氢酶（DAPDH，编码基因为 ddh）。

2.2.2 基因敲除

基因敲除育种是一种通过基因工程提高大肠杆菌赖氨酸生产能力的方法（Theisen and Liao, 2017）。这一过程通常涉及对大肠杆菌基因组中特定基因的定向敲除或突变，以优化代谢途径、减少副产物生成并增加赖氨酸产量。通过敲除与赖氨酸竞争的代谢通路基因（如酪氨酸和色氨酸合成基因）以及赖氨酸降解途径的关键酶基因，可以减少副产物的生成、降低赖氨酸的消耗，从而将更多的碳流量导向赖氨酸合成并提高其积累量（Ohno et al., 2014）。

此外，通过敲除或突变反馈抑制相关的基因（如 dapA），并增强赖氨酸合成途径中的关键酶（如 lysA），可以进一步提高赖氨酸合成效率。通过减少如乙酸和乳酸等副产物的生成，优化代谢网络并引入新代谢途径，还能进一步优化赖氨酸生产（Liu et al., 2023）。

基因编辑技术（如CRISPR/Cas9和λ-Red同源重组）已被应用于大肠杆菌的基因组改造（Zhao et al., 2016）。复合基因编辑方法也被探索，例如将λ-Red重组与同源核酸内切酶I-SceI或CRISPR/Cas9相结合。尽管CRISPR-Cas9通常用于基因敲除，但同时改变多个基因仍然具有挑战性（Su et al., 2020; Feng et al., 2018）。研究人员将CRISPR-Cas9与MetClo组装相结合，为大肠杆菌设计了标准化的迭代基因组编辑系统。该方法简化了引入多基因改造的过程，提高了效率（Dong et al., 2021）。这些技术使研究人员能够研究基因功能并优化代谢途径以生产高价值产品。

2.2.3 定向突变与启动子替换

定向突变是利用基因编辑技术对大肠杆菌基因组中的特定基因进行精确突变，以增强赖氨酸的合成或减少赖氨酸的降解途径（Simon et al., 2018）。通过对途径中关键酶基因进行突变，可以减少副产物的形成或提高关键酶的活性。例如，突变编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PPC）的基因，可以减少丙酮酸的消耗，从而增加赖氨酸前体的供应（Shimizu and Matsuoka, 2022; Yin et al., 2024）。此外，对编码调控因子的基因进行突变，可以缓解赖氨酸合成途径中的反馈抑制。例如，在L-赖氨酸合成途径中，针对编码天冬氨酸激酶（aspartokinase）的 lysC 基因和编码二氢二吡啶酸合酶的 dapA 基因进行定向突变，可以缓解赖氨酸对其生物合成途径的反馈抑制（Li et al., 2023）。

启动子替换是一种通过替换大肠杆菌基因启动子来调控目标基因表达的方法（Marschall et al., 2017）。通过将原来的弱启动子替换为强启动子，可以提高目标基因的转录水平，从而增强赖氨酸合成（Jin et al., 2019）。例如，将 dapA 基因的启动子替换为组成型的tac启动子，可以实现稳定高效的基因表达（Ying et al., 2014）。通过启动子工程，还可以设计对环境条件（如温度、pH值和营养物质）敏感的启动子，从而实现赖氨酸合成的动态调控（Wang et al., 2020）。

2.2.4 关键酶基因的过表达

通过过表达赖氨酸生物合成途径中的关键酶基因，可以增强这些酶的活性，从而提高赖氨酸产量（Li et al., 2017）。天冬氨酸激酶是这一途径中的关键调控酶，其活性受到赖氨酸的反馈抑制（Lo et al., 2009）。通过构建抗反馈抑制的 lysC 突变体并在大肠杆菌中过表达该基因，可以缓解这种反馈抑制，从而提高赖氨酸产量。二氢二吡啶酸合酶是赖氨酸生物合成的限速酶，其过表达可以显著加快赖氨酸合成。除了 lysC 和 dapA 外，对 dapB、dapD 和 lysA 等基因的过表达也能提高赖氨酸合成效率（Zhang et al., 2023）。例如，Xu J.等（2016）研究了高产赖氨酸菌株赖氨酸酯合成途径中的关键酶，包括二氢二吡啶酸合酶（DHDPS）和天冬氨酸激酶III（AK III），并通过改造这些酶以使其免受反馈抑制，从而增强其活性。

2.2.5 代谢途径优化

在大肠杆菌中，赖氨酸代谢涉及三羧酸循环（TCA）、糖酵解途径、二氨基哌啶酸途径和戊糖磷酸途径（图2）。通过调节糖酵解途径与戊糖磷酸途径之间的碳流比，可以增加NADPH的生成，从而有利于赖氨酸的生物合成（Tsuge and Kondo, 2017; Wendisch, 2017）。此外，引入一种异源多功能酶以取代多个原始酶促反应步骤，可以简化赖氨酸合成途径，从而提高生产效率。此外，通过增加代谢途径中赖氨酸合成前体的浓度，可以有效提升赖氨酸的产量（Banno et al., 2018）。

图2. 大肠杆菌的代谢工程改造以生产L-赖氨酸

图中的绿色箭头表示通过过表达相关酶基因增强合成途径，带有“X”的虚线表示被抑制的反应。这些基因编码的酶包括：

pgi：葡萄糖-6-磷酸异构酶；
zwf：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；
tkt：转酮酶；
pck：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；
pyc：丙酮酸羧化酶；
ppc：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；
icd：异柠檬酸脱氢酶；
sucCD：琥珀酰辅酶A合成酶；
aspC：天冬氨酸转氨酶；
ddh：二氨基哌啶酸脱氢酶；
lysA：二氨基哌啶酸脱羧酶。

2.2.6 辅酶平衡

在赖氨酸的生物合成途径中，NADH 和 NADPH 是关键的辅酶。优化这些辅酶的平衡可以显著提高赖氨酸的产量（Wang et al., 2017）。通过引入或过表达 NADH 氧化酶，可以减少 NADH 的积累，从而增加 NADPH 的可用量。此外，研究人员可以通过调控细胞的辅酶再生系统来优化 NADPH/NADH 的比例（Liu et al., 2018）。另一种方法是敲除或下调竞争性消耗 NADPH 的代谢通路，使更多的 NADPH 被用于赖氨酸的生物合成。例如，敲除某些与脂肪酸合成相关的基因可以减少 NADPH 的消耗。

赖氨酸的合成需要大量的 ATP。通过增强 ATP 生成途径，也可以提高赖氨酸的产量。例如，过表达 ATP 合酶可以增加细胞内的 ATP 水平（Gao et al., 2021）。此外，通过代谢流分析（MFA），研究人员可以定量分析细胞内辅酶的流向，并战略性地调整代谢途径以优化赖氨酸的生产。

总之，基因组编辑技术在提高大肠杆菌赖氨酸生产中的应用前景广阔，可为动物饲料和生物技术等行业带来巨大益处。研究人员将继续完善这些方法，以进一步提升菌株性能和产量（Chen et al., 2024a; Eggeling et al., 2015）。

2.3 多组学分析与计算机模拟

多组学分析和计算机模拟技术在赖氨酸生产大肠杆菌的育种研究中发挥了关键作用（St. John and Bomble, 2019）。这些技术为理解和优化大肠杆菌的代谢途径提供了新视角。通过基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等多层次组学分析，研究人员可以全面揭示影响大肠杆菌赖氨酸生产的关键基因、调控网络和代谢瓶颈。这些信息对于设计更高效的赖氨酸生产菌株至关重要（Becker and Wittmann, 2018）。例如，代谢组学分析可以帮助研究人员识别赖氨酸生产过程中重要的中间代谢物及其积累模式，从而通过基因改造提升生产效率（Ahmed et al., 2024）。

另一方面，计算机模拟技术，尤其是代谢网络建模和动态模拟，进一步提高了育种工作的精确性。通过这些工具，研究人员可以预测代谢工程策略的潜在影响，评估不同基因改造的有效性，并通过虚拟实验减少实际实验中的盲点和时间成本（Wang L. et al., 2021）。近年来，基于机器学习的计算机模拟工具也开始被应用于优化赖氨酸生产菌株。这些工具通过分析海量的组学数据来预测最佳的基因改造目标（Costello and Martin, 2018）。

调控代谢途径中单个或多个关键基因以增加目标代谢产物的生产需要经过多轮实验，来确定对生产率或产量有影响的酶（Chen et al., 2018）。数学工具的应用可以有效加速这一过程。例如，集合建模（Ensemble Modeling, EM）利用表型数据（如酶过表达或敲除对稳态产量的影响）选择能够描述现有数据的可能模型，从而改良赖氨酸生产菌株。最近的研究探索了一种策略，即通过表型数据筛选构建一组动态模型以捕捉细胞动态，并随后进行连续的酶过表达，从而证明了该方法的预测能力。例如，研究发现通过过表达抗反馈抑制的二氢二吡啶酸合酶（dapA），这些模型能够预测天冬氨酸激酶（lysC）的脱敏化为赖氨酸合成途径中的下一步限速步骤（Brockman and Prather, 2015）。此外，研究人员开发了一种将流量平衡模型与统计方法结合的创新计算策略，通过分析代谢网络中流量的相关性，提出了优化产品产量的流量重定向方法（Lee and Kim, 2015）。

2.4 创新技术

2.4.1 生物传感器

生物传感器在赖氨酸生产大肠杆菌的育种中提供了一种新颖、快速且灵敏的方法，用于筛选和优化高效菌株。生物传感器通常由一个能够特异性结合目标产物（如赖氨酸）的受体元件和一个能够产生可测信号的报告元件组成（Newman et al., 2011）。通过将这些传感器整合到大肠杆菌的基因组中，研究人员可以实时监测赖氨酸浓度，并根据信号强度筛选出高产菌株。这种方法显著减少了传统高通量筛选过程中繁琐的定量检测步骤，并大大提高了育种效率。例如，Wang等（2016）利用一种赖氨酸传感器从大气和室温等离子体（ARTP）诱变库中筛选出突变菌株MU-1，其转化率比原始菌株提高了9.05%，产量增加了21%。

近年来，随着合成生物学和基因编辑技术的进步，赖氨酸生产大肠杆菌的生物传感器育种领域取得了重要进展。最新研究集中于开发更精确和多功能的生物传感器。例如，一种基于转录调节因子LysG的传感器可以响应高浓度的赖氨酸并促进 lysE 基因的表达（Steffen et al., 2016）。通过将 lysE 基因与荧光蛋白基因融合，并利用荧光活性细胞分选（FACS）选择具有强荧光信号的细胞，可以获得高赖氨酸生产菌株（Ye et al., 2020）。

另一种传感器基于赖氨酸适配体核开关（aptamer riboswitch）与赖氨酸的相互作用，该相互作用具有调控作用（Shi et al., 2018; Wang et al., 2016）。例如，Yang等（2013）利用赖氨酸核开关调控 tetA 的表达。当细胞内赖氨酸浓度较高时，tetA 的表达被阻断，使细胞对四环素敏感。通过选择适当浓度的NiCl2作为选择压力，可以筛选出高赖氨酸生产菌株。他们利用该生物传感器优化了编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（ppc）的启动子，该酶在赖氨酸生产的代谢流分配中起关键作用，并从构建的 ppc 启动子库中鉴定出有利于赖氨酸酯生产的启动子（Wang W. et al., 2022）。

此外，研究人员还开发了能够同时检测多种代谢物或中间产物的多重生物传感器系统，为代谢途径优化提供了更全面的评估（Chu et al., 2022）。另一个重要进展是将机器学习与生物传感器结合，利用大数据分析预测并设计更高效的传感系统。这些技术的结合极大地提高了生物传感器在赖氨酸生产菌株育种中的应用潜力，进一步推动了大肠杆菌赖氨酸生产效率的提升。

2.4.2 高通量筛选

近年来，赖氨酸生物传感器与荧光激活细胞分选（FACS）的结合已建立了一种经典的高通量筛选策略（Della Corte et al., 2020）。该系统能够筛选含有质粒文库的细胞以及具有基因组突变的细胞。例如，Wang Yan等的研究提出了一种利用赖氨酸诱导型启动子进化工业赖氨酸生产菌株的新方法。基于由启动子控制的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）水平，通过荧光激活细胞分选从一个由高赖氨酸生产大肠杆菌突变产生的1000万个突变体库中初步筛选出186个菌株。随后，通过多参数评价赖氨酸浓度、产率及细胞特异性生产能力，最终筛选出两个突变株MU-1和MU-2。在5升发酵罐中，它们分别实现了136.51 ± 1.55 g/L和133.29 ± 1.42 g/L的赖氨酸产量。与原始菌株相比，MU-1的赖氨酸浓度和产率分别提高了21.00%和9.05%，而MU-2的相应提高为18.14%和10.41%。该研究开发的突变体筛选和评估系统可用于持续优化工业赖氨酸生产菌株（Fang et al., 2024；Schendzielorz et al., 2014）。

此外，液滴微流控技术允许在微小液滴中进行高通量筛选。利用质量激活液滴分选（MADS）技术，可以基于电喷雾离子化质谱（ESI-MS）测得的信号强度筛选高赖氨酸生产能力的细胞变体（Payne et al., 2023）。基于tRNA修饰的策略也可有效识别和筛选高氨基酸产率的菌株（Blay et al., 2020）。例如，北京理工大学的一个研究团队提出了一种名为AMINO的策略，利用合成的tRNA CUA筛选高产氨基酸的菌株。该策略通过修饰tRNA的反密码子，利用氨酰化反应降低tRNA对氨酰-tRNA合成酶的亲和力，从而筛选出高产目标氨基酸的菌株（Guo et al., 2023）。其他研究则利用大规模激活液滴分选（MADS）技术对微液滴中生长的大肠杆菌突变体进行高通量筛选。该方法通过基于ESI-MS测得的信号强度筛选液滴，筛选速率可达每秒0.5个样本，从而快速识别出高赖氨酸生产能力的突变体（Payne et al., 2023）。

2.4.3 定向进化

定向进化通过在体外模拟自然选择压力，使大肠杆菌逐步适应高赖氨酸生产环境，从而筛选出能够在高赖氨酸浓度条件下保持高生长和生产水平的突变株（Matsui and Asano, 2015）。最近，Xurong Yao及其同事设计了一种合成耐酸模块，用于精细调控多基因模块的表达。他们通过定向进化开发了一个酸响应型 asr 启动子文库，并从中筛选出四种变体用于构建合成模块。实验室菌株大肠杆菌MG1655首先被选择用于在弱酸性环境（pH 5–6）下生长，随后评估了工业赖氨酸生产菌株SCEcL3的赖氨酸生产性能。结果表明，这种合成生物学策略显著增强了这两种菌株在弱酸环境中的鲁棒性和生产能力（Yao et al., 2022）。

2.4.4 微生物共生体设计

利用微生物共生体设计进行赖氨酸生产的大肠杆菌育种已取得重要进展。研究人员将遗传工程改造的赖氨酸吸收型大肠杆菌与谷氨酸吸收型谷氨酸棒状杆菌结合，构建了一种合成的共生体系。在这一系统中，大肠杆菌分泌果糖作为碳源供谷氨酸棒状杆菌利用，而谷氨酸棒状杆菌合成并分泌L-赖氨酸，供大肠杆菌利用。这种互惠关系有效地将蔗糖转化为L-赖氨酸（Jia et al., 2016）。该方法不仅提高了L-赖氨酸的产量并降低了生产成本，还具有环境可持续性优势。通过利用每种微生物的代谢能力，该共生体优化了资源利用效率并提高了整体工艺效率。未来的研究可能进一步优化这些微生物群体，以扩大其在生物技术和工业过程中的应用（图3）。

图3. 菌株改造策略

该图展示了通过各种技术改造大肠杆菌菌株以提高L-赖氨酸产量的策略。

3 发酵工艺优化

构建或育种高产L-赖氨酸的优良菌株只是工业生产的初步阶段。为了充分发挥这些菌株的生产潜力，必须优化发酵工艺，以实现更高的生产效率和产品浓度。

3.1 培养方法

L-赖氨酸的大肠杆菌发酵方法主要包括连续发酵和分批补料发酵。

3.1.1 连续发酵

在连续发酵中，发酵液被连续补充和移除，从而使微生物保持在稳定的生长状态，延长生产周期并增加L-赖氨酸的积累量。该方法适用于长期高效生产，但需要较高的系统稳定性，因此必须对发酵条件进行精确控制。研究人员开发了智能控制系统，通过实时监测发酵参数（如pH值、溶解氧和葡萄糖浓度），实现发酵过程的自动化控制，从而进一步提高生产稳定性和L-赖氨酸产量。此外，采用新型生物反应器的设计改进（如膜生物反应器的应用），显著提高了连续发酵的效率（Chen et al., 2024b）。

3.1.2 分批补料发酵

分批补料发酵则是在发酵过程中逐步添加营养物质，以避免底物抑制效应和副产物的积累。由于其灵活性和易于控制性，分批补料发酵在工业生产中被广泛应用。通过精细调整补料策略，分批补料发酵可以显著提高L-赖氨酸的产量和生产效率（Rajpurohit and Eiteman, 2022）。研究人员探索了多种补料策略，如三磷酸钙、硫酸和活性炭预处理方法（TPSA），以提高糖的消耗率和L-赖氨酸产量。此外，开发了多模式补料策略（如分阶段补料和多底物补料），以最大化产量和生产效率（He et al., 2015）。

3.2 发酵条件

3.2.1 发酵温度

发酵温度是影响大肠杆菌赖氨酸生产效率的重要因素之一。温度直接影响细胞的代谢活性、酶功能以及生长速率。在赖氨酸发酵过程中，通常选择约37°C的温度，因为这是大肠杆菌的最佳生长温度，可最大化生物量积累和赖氨酸产量。然而，过高的温度可能会增强细胞的应激反应并降低酶活性，导致赖氨酸产量下降；相反，较低的温度可能会减缓代谢速率，但可以减少副产物生成并延长发酵周期。因此，精确的温度控制对于优化赖氨酸生产至关重要（Ma et al., 2021）。

最新研究表明，动态调控发酵温度可以进一步提高赖氨酸的生产效率。例如，在发酵初期维持较高的温度可以促进大肠杆菌的快速生长和早期产品积累，而在后期降低温度可以减少副产物生成并延长细胞活力，从而提高最终赖氨酸产量。此外，一些研究探索了温度敏感性调控元件的应用，使大肠杆菌能够根据温度变化自动调整其代谢途径，最大化赖氨酸的合成。通过计算机模拟和系统生物学方法，研究人员可以预测细胞在不同温度条件下的代谢行为，从而优化发酵过程。这些动态温度控制策略和智能调控方法的应用在赖氨酸的工业规模生产中具有重要潜力。

3.2.2 溶解氧

溶解氧（DO）在大肠杆菌赖氨酸生产的发酵过程中起着至关重要的作用，影响着细胞生长、代谢活动和最终L-赖氨酸的产量。大肠杆菌是需氧微生物，在发酵过程中，充足的氧气供应可以促进碳源的高效代谢，从而提高细胞生长速率和产品积累。然而，过高的DO水平可能引发氧化应激，抑制赖氨酸的合成；而DO不足可能导致代谢副产物的积累并降低发酵效率。因此，维持适宜的DO水平对于大肠杆菌高效生产L-赖氨酸至关重要。

溶解氧的智能监测与动态控制已成为研究的重点。先进的传感器技术可实现DO水平的实时监测，并结合计算机控制系统，根据发酵过程不同阶段的氧需求进行动态调节（Zhou et al., 2011）。此外，研究还探索了通过优化搅拌速度、通气速率，以及采用微气泡增氧技术来提高氧传递效率的方法，确保大肠杆菌在高密度培养条件下获得充足的氧气供应。

3.2.3 发酵pH

pH直接影响细胞的生理状态、酶活性和代谢途径的平衡。在发酵初期，较低的pH有利于大肠杆菌的快速生长；然而，随着发酵的进行，L-赖氨酸的积累可能会导致培养基的酸化。如果不加以控制，pH的降低可能抑制细胞活性并减少赖氨酸的产量。因此，维持最佳pH对实现高效L-赖氨酸生产至关重要。

缓冲体系可用于稳定发酵过程中的pH并减少其对赖氨酸生产的影响。例如，添加磷酸盐等缓冲剂或调整培养基的初始pH值可以提供高缓冲能力并保持稳定的pH水平（Ferreira et al., 2015）。此外，通过添加碳酸钙等弱碱中和发酵酸，也能帮助调节pH。氨的中和作用也是一种常见的调控方法。

3.2.4 培养基配方

培养基的组成对提高大肠杆菌赖氨酸生产具有重要作用。传统发酵培养基通常由碳源、氮源、无机盐、微量元素和维生素组成。常见碳源包括葡萄糖、蔗糖和玉米浆，碳源的选择和浓度直接影响微生物细胞的生长速率和赖氨酸积累。氮源通常包括酵母提取物、大豆粉水解液或无机氮（如铵盐），为细胞生长提供必需的氨基酸和其他含氮化合物。此外，无机盐和微量元素（如磷酸盐、硫酸盐、钙、镁和锌）在代谢活动中起重要作用，而维生素（如生物素和烟酸）对维持酶活性和促进代谢至关重要（Wang et al., 2023）。

通过响应面分析等优化方法，可以系统地确定培养基组成的最佳条件。近年来，人们还关注非传统碳源（如甘油和纤维素水解液）作为培养基替代品的潜力。这些新型碳源不仅提高了赖氨酸产量，还具有降低生产成本和减少废弃物排放的优势。此外，开发适应高密度发酵的大肠杆菌专用培养基，以及集成pH调控和泡沫控制的多功能培养基配方，已成为当前研究的热点。

3.3 赖氨酸的分离与纯化

生产中的关键因素之一是赖氨酸的分离与纯化。开发适当的分离和提取方法对于提高产品产量和降低生产成本至关重要。

3.3.1 传统分离方法

3.3.1.1 反向胶束萃取与溶剂萃取

反向胶束萃取和溶剂萃取是最常用的方法之一。反向胶束萃取操作简单，支持连续操作，并能获得具有高催化活性的产品。然而，其主要局限在于有效分离需要溶液中离子浓度非常低（Chaurasiya and Hebbar, 2017）。此外，表面活性剂与氨基酸离子之间的静电相互作用会影响萃取效率。近年来，研究人员通过开发新型双子表面活性剂和多功能添加剂，提高了反向胶束系统的稳定性和赖氨酸的萃取效率。此外，将反向胶束萃取与膜分离技术结合也正在被探索，以提高萃取效率并减少能耗。

3.3.1.2 酸沉淀

酸沉淀通过向发酵液中添加酸（如盐酸、硫酸或其他有机酸），降低pH值，使赖氨酸从溶液中沉淀出来。赖氨酸的等电点通常约为pH 9.5，在酸性环境中，赖氨酸分子带正电荷，与酸结合形成溶解度较低的赖氨酸盐，从而沉淀。酸沉淀操作简单，能够在短时间内有效分离赖氨酸。研究表明，通过优化酸的选择与浓度，以及与膜分离技术结合，可以进一步提高赖氨酸的纯度与回收效率（Chen et al., 2020）。

3.3.1.3 离子交换树脂

离子交换树脂是一种具有功能性离子基团的多孔聚合物，可通过可逆的离子交换反应从溶液中分离带电的赖氨酸分子。在赖氨酸提取中通常使用阳离子交换树脂，因为在大多数发酵液的pH条件下，赖氨酸表现为带正电荷的阳离子。离子交换树脂对赖氨酸具有高选择性，并且操作条件温和。近年来，研究人员开发了具有更大比表面积和更高离子交换容量的树脂，显著提高了赖氨酸的吸附效率。此外，引入具有特殊功能基团的树脂增强了赖氨酸的选择性吸附，减少了杂质的共吸附（Chen X. et al., 2019）。固定化树脂和多功能树脂的应用也越来越普遍，以提高整体工艺效率和稳定性。近期研究还探索了高效的树脂再生方法，例如优化再生溶液的组成以及采用辅助再生技术（如超声或微波辅助），以延长树脂寿命，同时保持其高效性（Zhang et al., 2011; Ecker et al., 2012; Li et al., 2012; Yokoyama et al., 2013）。

3.3.1.4 膜分离

膜分离技术利用具有特定孔径的膜将溶液中的不同组分分离开来。根据孔径和膜特性，膜分离技术主要分为微滤（MF）、超滤（UF）、纳滤（NF）和反渗透（RO）（Wang K. et al., 2022）。在赖氨酸提取中，超滤和纳滤被广泛应用。膜污染是限制膜分离技术发展的主要瓶颈。近年来，开发了各种抗污染膜技术，如表面涂层技术、动态膜技术和表面功能化技术。这些方法通过在膜表面引入疏水性、抗菌或超润湿涂层，大幅降低了膜污染，提高了分离过程的稳定性和效率。膜生物反应器结合了膜分离技术与生物反应器，在发酵与分离提取过程中实现了一体化操作（Du Y. et al., 2022）。

3.3.1.5 电渗析

电渗析利用具有选择性离子交换功能的膜（阳离子膜和阴离子膜），在直流电场作用下从发酵液中分离带电分子如赖氨酸（Doble, 2016）。赖氨酸在溶液中以带正电的离子形式存在，在电场作用下通过阳离子交换膜移动，而其他杂质通过阴离子交换膜或被保留，从而实现赖氨酸的浓缩和纯化。电渗析具有节能的优势，但需要对操作条件（如电流密度和流速）进行精确控制。此外，电渗析膜容易受到污染和结垢的影响，从而降低分离效率。

3.3.2 新兴分离技术

3.3.2.1 超声辅助提取

超声辅助提取技术利用超声波在液体中传播所产生的空化效应。该效应在局部产生高温高压，从而破坏细胞壁并增加细胞内物质的渗透性，从而提高提取效率（Shen et al., 2023）。这种方法以其高效、节能和环保的特点在大肠杆菌赖氨酸生产的提取和分离中表现出很大的潜力。

3.3.2.2 酶解

酶解是指通过酶选择性降解细胞壁或细胞膜，使细胞内的赖氨酸释放出来进行提取和分离（Yi et al., 2023）。该方法具有高特异性和温和的反应条件，避免了赖氨酸在化学提取过程中可能发生的降解或副产物的生成。

3.3.2.3 反相高效液相色谱

反相高效液相色谱（RP-HPLC）是一种广泛用于生物分子（包括赖氨酸）分离、纯化和分析的方法。RP-HPLC通过非极性固定相与极性流动相之间的分配系数差异分离赖氨酸（Zhang et al., 2024）。该方法以其高分辨率、优异的选择性和效率著称，能够实现赖氨酸的精确分离和定量分析（图4）。

图4. L-赖氨酸生产

(a) L-赖氨酸生产的连续发酵工艺；(b) L-赖氨酸发酵液的分离与精制。

4 赖氨酸衍生物

赖氨酸广泛用作饮料、饲料和食品工业中的营养补充剂和化学中间体。此外，赖氨酸作为高价值化学品的前体在制药、活性药物成分（API）和材料领域显示出巨大的潜力。

4.1 用于生物基材料的赖氨酸衍生物

腐胺（1,5-二氨基戊烷） 在工业和农业领域有多种用途。生物基腐胺是生物基聚酰胺（如PA 54、PA 510和PA 512）的重要平台化学品（Kim et al., 2017）。腐胺的生产可以通过全细胞生物催化或微生物发酵实现，包括重组大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌（Gevrekci, 2017）。经过工程改造的菌株已显示出提高的腐胺产量，其中大肠杆菌的最大产量达到9.61 g/L（Li et al., 2020）。此外，全细胞生物转化是从L-赖氨酸高效合成腐胺的可行方法。

5-氨基戊酸（5AVA） 是生产尼龙5、尼龙6,5和其他五碳衍生物（如戊内酰胺、戊二酸、1,5-戊二醇和5-羟基戊酸）的前体，是一种有前景的平台化合物（Liu et al., 2014）。这些化合物广泛应用于塑料、太阳能电池和人工抗原。5AVA的生产已经探索了多种生物合成途径，一种方法利用假单胞菌的天然途径；另一种方法通过δ-氨基戊酰胺酶（DavA）和赖氨酸2-单加氧酶（DavB）介导的生物合成途径，从L-赖氨酸开始，先转化为5-氨基戊酰胺，然后水解生成5AVA。这一策略在工程改造的大肠杆菌中实施，最终产量达到57.52 g/L（Jorge et al., 2017）。此外，一种新型途径使用木霉的L-赖氨酸α-氧化酶（LysOx）将L-赖氨酸酯的α-碳氧化为6-氨基-2-酮己酸，然后脱羧生成5AVA，无需催化酶。

δ-戊内酰胺 是一种有机化合物，通常通过5-氨基戊酸（5AVA）的真空条件下环化和脱水获得（Park et al., 2014）。这些化合物被用作尼龙5和尼龙6,5的前体。过表达链霉菌乙酰辅酶A合成酶ORF26的重组大肠杆菌可以生产δ-戊内酰胺和ε-己内酰胺（Zhang et al., 2017）。此外，通过激活丙酸梭菌的β-丙氨酸辅酶A转移酶（Act）构建了从ω-氨基酸合成ε-己内酰胺和δ-戊内酰胺的高效代谢途径（Chae et al., 2017）。另一种创新的基于L-PA的方法是在氧化脱羧酶催化下将L-PA转化为δ-戊内酰胺。

ε-己内酰胺 是尼龙6,5合成的起始材料，也是尼龙6合成中的主要化学物质。研究人员开发了一种从生物质来源赖氨酸化学转化为ε-己内酰胺的途径（Kumar et al., 2019）。该过程包括环化和后续转化步骤生成α-氨基-ε-己内酰胺，后者可进一步用于尼龙6的制备。此外，通过纯化的生物合成中间体的环化也可以生产ε-己内酰胺，这一方法有望取代传统的石油基ε-己内酰胺生产工艺。

4.2 用于制药的赖氨酸衍生物

L-哌啶酸（L-PA） 是一种重要的非蛋白原生氨基酸，广泛用作多种药物和生化化合物合成的关键中间体。目前，L-PA的合成主要通过两种方法实现：生物合成和化学合成。由于化学合成程序复杂且产率低，生物合成凭借其高效和环保的优势受到全球化学公司的广泛关注。已知L-PA的生物合成有四种途径，包括通过赖氨酸的α-氮脱除和ε-氮缩合生成L-PA，以及通过ε-氮脱除结合赖氨酸和α-氮的途径。这些方法为L-PA的大规模手性生产提供了经济可行的途径。

6-氨基己酸（6ACA） 是一种广泛使用的非天然氨基酸，因其能够抑制纤溶酶、胃蛋白酶和弹性蛋白酶等酶的活性，从而有效治疗某些出血性疾病（Grottke et al., 2013）。此外，6ACA是尼龙6生产的重要组成部分。从赖氨酸等生物来源生产6ACA具有显著减少炼化排放和提高生物安全性的潜力。尽管已经探索了各种生物合成途径，但这些工程方法仍需进一步的实验验证。

5 结论

本综述探讨了通过优化大肠杆菌菌株和发酵工艺以提高L-赖氨酸生产的多种策略。主要方法包括代谢途径的基因工程改造、调控机制的优化以及发酵条件的改进。通过针对L-赖氨酸生物合成途径的瓶颈进行优化，产量和生产效率得到了显著提升。此外，合成生物学和基因组编辑技术（如CRISPR/Cas9）的进步为更精确、高效的菌株工程开辟了新途径（Pu et al., 2023）。

尽管取得了这些进展，但仍存在许多需要解决的挑战。主要问题之一是生长与生产之间的平衡，因为最大化L-赖氨酸产量通常会削弱微生物细胞的整体适应性（Liu and Wang, 2021）。此外，工程化菌株中代谢流和调控网络之间的复杂相互作用可能导致意外结果，需要进一步优化和反复测试（Pang et al., 2022）。在大规模工业生产中，生产成本上升、环境污染加剧以及高底物消耗是主要挑战。目前的分离和纯化工艺需要大量的酸碱试剂和水，导致成本增加和环境负担，造成资源浪费，并阻碍赖氨酸生产的发展。膜分离技术以其节能、无相变、操作简单、可扩展性强及无需化学试剂等优势，能够显著提升L-赖氨酸的分离与纯化，从而为企业实现绿色生产提供重要支持（Zhang et al., 2019）。

展望未来，研究应聚焦于将系统生物学方法与机器学习和人工智能相结合，以预测并设计更高效的生产菌株。此外，探索共培养系统和动态控制策略可能为克服单菌株发酵的局限性提供新机会（Van Lent et al., 2023）。随着代谢工程技术的不断进步，我们可以期待更多创新方法的出现，以进一步提高L-赖氨酸的产量和质量。