Ras鸟嘌呤核苷酸释放蛋白2（RASGRP2）是鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）之一，近年来备受关注。然而，RASGRP2 与肺腺癌（LUAD）的免疫浸润和恶性特征之间的相关性却很少被提及。
1. 筛选 LUAD 中 DEGs 和 GEFs 的交集情况
在 GSE7670 中，共获得了 715 个上调基因和 1419 个下调基因（|log2(FC)| > 1, P< 0.05) were obtained in GSE116959. A total of 493 up-regulated genes and 722 down-regulated genes (|log2(FC)| > 1, P< 0.05）（图 1A, B ）。由于差异基因的数量较多，这里只将前 20 个上调基因和下调基因分别绘制成热图（图 1A, B ）。根据相关性得分，作者从基因卡片中提取了前 500 个 GEF。作者将 GSE116959 中的 2134 个 DEGs、GSE7670 中的 1215 个 DEGs 和 500 个 GEFs 交集在一起，筛选出了 40 个感兴趣的基因（图 1C）。随后，使用 LASSO 回归算法通过计算回归系数来完善基因集（图 1D、E）。通过这种方法，7 个蛋白质被确定为最有价值的 GEF（图 1F）。临床相关性分析显示，只有 RASGRP2 的表达水平在 LUAD 的不同 T 期和病理分期中具有统计学意义。而 RASGRP2 在 LUAD 中的作用尚未见系统报道。因此，作者选择 RASGRP2 作为后续机制探索的对象。
图1 筛选 LUAD 中 DEGs 和 GEFs 的重叠
2. RASGRP2 的表达及其在 LUAD 中的预后和诊断价值分析
为了确定RASGRP2与LUAD的关系，作者通过GEO数据库的数据评估了RASGRP2在LUAD组织和非肿瘤组织中的表达水平。结果显示，RASGRP2的mRNA和蛋白表达水平在LUAD中均显著降低（P < 0.001）（图2A、B）。来自 HPA 数据库的 IHC 结果也显示了 RASGRP2 在 LUAD 中的低表达水平（图 2C）。此外，RASGRP2的低表达还与晚期T分类（P＜0.001）、病理分期（P＜0.05）、年龄（P＜0.05）和吸烟（P＜0.05）相关（图2D）。
图2 在LUAD中，RASGRP2的表达明显降低，且与恶性临床病理参数相关
为了进一步评估RASGRP2的预后和诊断价值，Kaplan-Meier曲线比较了TCGA-LUAD队列中RASGRP2高表达和低表达患者的总生存期（OS）（P = 0.005）、疾病特异性生存期（DSS）（P = 0.022）和无进展间期（PFI）（P = 0.025）（图3A-C）。亚组分析显示，RASGRP2低表达与65岁以上男性患者（P = 0.04）（P = 0.014）和女性患者（P = 0.016）的不良预后显著相关（图3D-F）。为证明RASGRP2的诊断价值，对其进行了接收者操作特征曲线（ROC）分析。RASGRP2 表达的曲线下面积（AUC）从 0.754 到 0.959 不等，表明 RASGRP2 与 LUAD 诊断之间具有很强的相关性（图 3G-L）。综上所述，RASGRP2可能是LUAD诊断和预后的潜在生物标志物。
图3 RASGRP2在LUAD中的预后和诊断价值
3. RASGRP2在LUAD中的预后和诊断价值
LUAD是一种具有高度异质性和遗传因素的严重癌症。作者从 TCGA-LUAD 中分析了 RASGRP2 表达与体细胞突变之间的关联。图 4A 和 B 显示了前 20 个明显不同的体细胞突变。结果显示，在 RasGRP2 低表达组中，TP53、TTN、CSMD3、MUC16 和 KRAS 的突变频率较高。这些突变基因是已知的 LUAD 生物标志物，对评估肿瘤恶性进展或治疗反应具有重要价值。DNA 甲基化在基因表观遗传学研究中是不可或缺的。作者使用 MethSurv 工具研究了 RASGRP2 的 DNA 甲基化水平以及每个单 CpG 的预后价值（图 4C）。有 2 个 CpG 位点的甲基化水平与预后密切相关，即：cg00156756 和 cg01753544（图 4D）。接下来，作者利用 CPTAC 数据集比较了正常组织和肿瘤组织中 RASGRP2 的磷酸化情况。如图 4E-G 所示，作者发现在 LUAD 的原发性肿瘤组织中，RASGRP2 的 S123、S578 和 S587 的磷酸化水平显著降低。RasGRP2 最重要的功能是激活小 GTP 酶 Rap1。一般来说，RASGRP2的磷酸化受蛋白激酶A（PKA）和细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）调控，并被抑制以激活小GTP酶Rap1。
图4 LUAD 中 RASGRP2 的突变、甲基化和磷酸化
4. 构建 RASGRP2 上游调控网络
作者分析了RASGRP2的上游调控机制，筛选了靶向RASGRP2的转录因子（TFs）和miRNA。作者从CHEA数据库和GRNbd数据库分别找到了26个和38个可能以RASGRP2为靶标的转录因子。因此，作者筛选出 ATF1、FLI1、MYC、FOS 和 TCF7 是最重要的 TFs（图 5A）。作者分析了这 5 个潜在 TFs 在 LUAD 中的表达水平及其与 RASGRP2 的相关性（图 5B, C）。结果表明，FLI1在LUAD中表达下调，与RASGRP2的相关性最高（r = 0.672，P < 0.001）（图5D）。此外，FLI1高表达的LUAD患者预后较好（图5E），这与RASGRP2一致。图 5F 显示了预测的 TF 结合基序。随后，作者根据 miRWalk、mirDIP 和 TargetScan 探索了 RASGRP2 的上游 miRNA 调控因子。首先，通过三个数据集的交叉得到了预测的 miRNA（图 5G）。接着，利用表达分析和预后分析进行进一步筛选。结果表明，最有可能参与 RASGRP2 转录后调控的 miRNA 是 hsa-miR-1976 （图 5H、I ）。作者还展示了 RASGRP2 与 hsa-miR-1976 之间的互补序列（图 5J）。在此基础上，作者构建了 LUAD 中 FLI1-hsa-miR-1976-RASGRP2 的转录网络（图 5K）。
图5 RASGRP2 的 TF-miRNA-mRNA 调控网络
5. RASGRP2 在 LUAD 中的潜在作用机制
为了阐明RASGRP2的相关基因并进一步探讨RASGRP2在LUAD发育过程中的潜在反作用，作者进行了加权基因共表达网络分析（WGCNA）（图6A-F）。通过平均关联分层聚类，所有 DEGs 被分为 15 个模块。由 379 个基因组成的蓝色模块与 RASGRP2 表达的相关性最高（r = 0.61，P < 0.0001）（图 6G）。蓝色模块中的 43 个基因被选为中枢基因（图 6H）。
图6 筛选 LUAD 中与 RASGRP2 相关的模块和基因
根据基因本体（Gene Ontology，GO）注释分析（图 7A），379 个蓝色模块基因中，RASGRP2 与生物过程（BP）中的中性粒细胞活化、中性粒细胞活化参与免疫反应和中性粒细胞介导的免疫相关；与细胞组分（CC）中的分泌颗粒膜、三级颗粒和质膜外侧相关；与分子功能（MF）中的货物受体活性和碳水化合物结合相关。京都基因组百科全书》（KEGG）分析（图 7B）显示，RASGRP2 参与细胞因子-细胞因子受体相互作用、吞噬体、趋化因子信号通路和细胞粘附。此外，基因组富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）通过比较高RASGRP2表达组和低RASGRP2表达组发现了可能的机制（图7C、D）。高RASGRP2可能富集于B细胞受体信号通路和趋化因子信号通路。而低RASGRP2与基础转录因子、DNA复制和错配修复相关。
图7 RASGRP2 在 LUAD 中的潜在机制
为了更好地了解LUAD中的RASGRP2共表达基因，作者通过LinkedOmics网站构建了另一个模块--LinkFinder模块（图7E）。热图用于显示前 50 个基因（图 7F、G）。在前50个正相关基因中，有43个基因对LUAD具有保护性危险比（HR）。另一方面，45个负相关基因中有41个具有高HR，有可能是高风险标记（图7H）。GO分析表明，RASGRP2可能参与了T细胞活化、淋巴细胞分化和抗原受体介导的信号通路的调控（图7I）。KEGG 分析表明，RASGRP2 可能参与了趋化因子信号通路、原发性免疫缺陷通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用通路（图 7J）。
6. RASGRP2 与 LUAD 的免疫浸润有关
根据上述结果，作者发现RASGRP2与免疫细胞、细胞因子和趋化因子有关，因此作者试图探讨RASGRP2与免疫浸润之间的关系。TCGA-LUAD的ESTIMATE算法显示，RASGRP2在LUAD中的表达与ESTIMATE评分（r = 0.587，P < 0.001）、免疫评分（r = 0.647，P < 0.001）和基质评分（r = 0.434，P < 0.001）呈正相关（图8A）。RASGRP2 的表达水平与大多数免疫细胞的浸润呈正相关（图 8B），前三位分别是 B 细胞（r = 0.517，P < 0.001）、Th1 细胞（r = 0.500，P < 0.001）和细胞毒性细胞（r = 0.499，P < 0.001）。然而，RASGRP2的表达与Th2细胞呈负相关（r = -0.291，P < 0.001）（图8C）。
图8 RASGRP2 与 LUAD 的免疫浸润呈正相关
7. 单细胞分析 RASGRP2 在 LUAD 不同免疫细胞中的表达情况
基于scRNA-seq TISCH数据库，作者获得了4个独立的LUAD数据集（NSCLC_GSE127471、NSCLC_GSE131907、NSCLC_GSE139555和NSCLC_GSE99254）进行单细胞测序，以探讨单细胞水平上免疫细胞分布与RASGRP2表达水平的相关性（图9A）。在 NSCLC_GSE127471 数据集中，CD8 T 细胞、NK 细胞和 B 细胞的 RASGRP2 表达水平较高（图 9A、B）。此外，在 NSCLC_GSE99254 数据集中，RASGRP2 在 CD4 T 细胞和单核-巨噬细胞中也有高表达的趋势（图 9A、C）。这可能是由于肿瘤的异质性造成了数据集之间的差异。总之，RASGRP2 的表达水平与免疫细胞类型及其比例显著相关，这可能会影响免疫疗法的反应。
图9 单细胞分析 RASGRP2 在 LUAD 不同免疫细胞中的表达
8. RASGRP2 与免疫抑制剂、免疫刺激剂、趋化因子和趋化因子受体的相关性分析
然后，作者通过 TISIDB 分析进一步验证了 RASGRP2 与免疫抑制剂、免疫刺激剂、趋化因子和趋化因子受体之间的相关性。结果表明，RASGRP2的表达与大多数免疫抑制剂呈正相关（图10A）。至于 LUAD，前三位分别是 BTLA（rho = 0.671，P < 2.2e-16）、CTLA4（rho = 0.562，P < 2.2e-16）和 PDCD1（rho = 0.507，P < 2.2e-16）（图 10B）。RASGRP2 的表达与大多数免疫刺激因子呈正相关（图 10C）。至于 LUAD，前三位分别是 TNFRSF13B（rho = 0.685，P < 2.2e-16）、CD40LG（rho = 0.675，P < 2.2e-16）和 LTA（rho = 0.618，P < 2.2e-16）（图 10D）。RASGRP2 的表达与大多数趋化因子呈正相关（图 10E）。就 LUAD 而言，前三位分别是 CCL19（rho = 0.683，P < 2.2e-16）、CCL14（rho = 0.555，P < 2.2e-16）和 CCL17（rho = 0.500，P < 2.2e-16）（图 10F）。RASGRP2 的表达与大多数趋化因子受体呈正相关（图 10G）。至于 LUAD，前三位分别是 CCR7（rho = 0.747，P < 2.2e-16）、CXCR5（rho = 0.686，P < 2.2e-16）和 CCR6（rho = 0.642，P < 2.2e-16）（图 10H）。
图10 通过 TISIDB 分析 RASGRP2 与免疫抑制剂、免疫刺激剂、趋化因子和趋化因子受体的相关性
9. 根据 RASGRP2 的表达水平以及与免疫相关标记物的相关性
为了验证上述结果，作者通过 qRT-PCR 分析了 16 例配对 LUAD 组织和邻近组织的 RASGRP2 表达水平（图 11A）。此外，晚期患者的 RASGRP2 表达水平较低（图 11B、C）。作者还检测了RASGRP2与TCGA-LUAD中与RASGRP2密切相关的免疫相关分子之间的相关性。在RASGRP2高表达组中，PDCD1、CTLA4、CD40LG、CCL14、CXCR5和CCR7的表达水平较高。但TNFRSF13B和CCL19在统计学上没有显著相关性（图11D）。原因可能是样本有限。作为流行的免疫检查点，PDCD1 和 CTLA4 在临床实践中发挥着越来越广泛的作用。作者分析了 RASGRP2 与 PDCD1/CTLA4 的相关性。图 11E 和 F 显示，RASGRP2 与 PDCD1（r = 0.535，P = 0.035）和 CTLA4（r = 0.626，P = 0.011）呈正相关。随后，作者在细胞系双重染色中进一步验证了 RASGRP2 与 PDL1 的关系。众所周知，PDL1 被认为是免疫疗法有效性的预测因子。免疫荧光实验证实，高RASGRP2与高PDL1相对应。上述结果表明，RASGRP2水平高的患者可能从免疫疗法中获益更多。
图11 在真实世界队列中验证 RASGRP2 的表达水平和免疫相关分子浸润
10. RASGRP2 通过调节 LUAD 细胞凋亡抑制细胞增殖
首先，作者分析了 RASGRP2 在 6 种不同肺癌细胞系中的表达水平 ( 22)。RASGRP2 在 A549 和 H2228 中表达较低，但在 H358 中表达较高（图 12A）。接下来，作者在 A549 和 H2228 细胞系中过表达了 RASGRP2，并进行了效率验证（图 12B）。集落形成试验和 EdU 试验的结果证实，高 RASGRP2 会显著削弱细胞的增殖能力（图 12C-F）。流式细胞术分析表明，过表达 RASGRP2 会增加凋亡细胞的比例（图 12G、H）。细胞凋亡过程往往伴随着 MMP 的破坏。当 RASGRP2 被过量表达时，JC-1 单体比例的增加表明细胞发生了凋亡（图 12I, J）。同时，作者通过沉默 H358 中的 RASGRP2 得到了相反的结果。
图12 过表达 RASGRP2 可通过调节细胞凋亡抑制 LUAD 的增殖
总结
RASGRP2是LUAD潜在的免疫相关生物标志物。此外，RASGRP2还通过调控线粒体依赖性凋亡参与了LUAD的恶性进展。
